Губернатор Нью-Йорка Эндрю Куомо обвинен в домогательствах. Его называли звездой либеральной Америки и прочили в президенты

3 августа 2021

Автор фото, Reuters

Подпись к фото,

Еще недавно Куомо был звездой либеральной Америки. Сейчас его обвиняют в харрасменте

Расследование в отношении губернатора Нью-Йорка Эндрю Куомо свидетельствует, что он домогался многих женщин, включая сотрудниц своего офиса. Объявляя результаты расследования, генеральный прокурор Нью-Йорка Летиция Джеймс подчеркнула, что губернатор-демократ тем самым нарушил законы штата и федеральные законы.

В прошлом году несколько женщин обвинили Куомо в сексуальных домогательствах. Куомо отвергал обвинения в том, что трогал женщин неподобающим образом, и отказался уйти в отставку, несмотря на призывы своих коллег-демократов.

Теперь губернатору может быть объявлен импичмент, американская полиция также может возбудить против него уголовное дело.

В ответ на результаты расследования президент США Джо Байден заявил, что Куомо следует уйти со своего поста. «Я думаю, он должен подать в отставку, — сказал Байден журналистам в Белом доме. — Насколько я понимаю, законодательный орган штата может принять решение об импичменте. Этого мне пока точно не известно. Я еще не ознакомился со всеми сведениями».

Расследование в отношении губернатора длилось около месяца, следователи опросили почти 200 человек, в том числе его сотрудниц и некоторых женщин, жаловавшихся ранее на Куомо. Были изучены десятки тысяч документов, фотографий и текстовых сообщений.

«В итоге независимое расследование пришло к заключению, что губернатор Нью-Йорка домогался множества женщин и, поступая таким образом, нарушил федеральные законы и законы штата», — заявила генеральный прокурор Нью-Йорка. Куомо, по ее словам, трогал женщин без их согласия и одобрения и позволял себе многочисленные оскорбительные комментарии.

В одном случае Куомо и его подчиненные предприняли ответные действия против бывшей сотрудницы, обвинившей губернатора в неподобающем поведении, сказала Летиция Джеймс.

Другие женщины рассказывали, как губернатор их щупал, целовал и сажал к себе на колени. Его ассистентка обвинила губернатора в том, что он залез ей под блузку и схватил за грудь.

Всего с обвинениями против 63-летнего главы штата выступили 11 женщин, девять из которых по-прежнему находятся на госслужбе.

Среди них — сотрудница полиции, которую губернатор, проходя мимо, несколько раз погладил по животу, спросив, сколько ей лет. «Еще нет 30», — ответила полицейская. На это недавно разведенный Куомо пошутил, что она «слишком стара для него».

Согласно материалам расследования, губернатор предлагал своей помощнице Шарлотт Беннетт сделать татуировку на интимных частях тела, интересуясь, есть ли у нее где-нибудь на теле пирсинг.

Вдобавок на Куомо жалуются еще и из-за того, что он, по словам его критиков, создал у себя в офисе невыносимую рабочую обстановку.

«Это была обстановка, в которой нельзя было сказать губернатору «нет», а если вы расстроили его или кого-то из руководства, вас могли списать со счетов, задвинуть по службе, а то и хуже», — рассказывает один из руководителей расследования Джун Ким.

«При этом, по словам свидетелей, ежедневный флирт, физическая близость и неподобающие комментарии губернатора были в порядке вещей», — говорит он.

Автор фото, EPA

Подпись к фото,

Джун Ким обвинил Куомо в том, что губернатор создал нетерпимую обстановку в своем офисе

Сам Куомо категорически отвергает обвинения в домогательствах.

«Я хочу, чтобы вы знали непосредственно от меня, что я никогда никого не трогал неподобающим образом и никого сексуально не домогался. Мне 63 года. Я всю жизнь прожил на виду у публики. Я не такой и никогда таким не был», — заявил во вторник Эндрю Куомо.

Сам виноват

Кирилл Белянинов, Би-би-си, Вашингтон

Губернатор-демократ Эндрю Куомо, ставший за время пандемии одним из самых известных политиков в Соединенных Штатах, может винить только себя в разгоревшемся скандале.

В марте этого года, после того, как несколько женщин, работавших в администрации штата, заявили о сексуальных домогательствах со стороны губернатора, Куомо лично поручил генеральному прокурору Летиции Джеймс начать расследование этих обвинений.

Результаты этого расследования генпрокурор и огласила во вторник, заявив, что теперь губернатор Куомо должен принять решение о своей отставке.

В начале этой недели сразу несколько ведущих американских СМИ сообщили, что следователи из группы, созданной генпрокурором штата Нью-Йорк, в течение 11 часов допрашивали губернатора Куомо.

После этого анонимный сотрудник канцелярии главы штата сообщил, что сам губернатор считает, что допрос прошел «очень хорошо».

«Он достаточно умен для того, чтобы понимать, что вы никогда не узнаете все детали того, что могло происходить» — добавил чиновник.

Похоже, правда, что члены законодательного собрания штата Нью-Йорк придерживаются другого мнения.

Еще весной этого года Куомо, занимавший свой пост три срока подряд, заявил, что собирается выдвинуть свою кандидатуру на четвертый.

Теперь делегаты собрания обсуждают возможность объявления импичмента губернатору. В поддержку именно такого решения уже высказались более 50 законодателей, в том числе и многие демократы.

Комментируя эту инициативу, спикер законодательного собрания Карл Хисти счел нужным уточнить, что претензии к губернатору вовсе не ограничиваются обвинениями в сексуальных домогательствах.

Законодатели намерены привлечь Куомо к ответу за ошибки, допущенные властями штата в борьбе с пандемией коронавируса. В числе претензий лично к губернатору — отданное им в марте 2020 года распоряжение о размещении больных коронавирусом в домах престарелых.

Только за последний год, согласно результатам отдельного расследования генпрокуратуры штата, число смертей от вируса в домах престарелых превысило 4 тыс. человек.

Законодатели собираются выяснить также, насколько соответствовали закону попытки самого Куомо заработать на пандемии.

В разгар эпидемии губернатор опубликовал книгу мемуаров «Американский кризис», посвященную тому, как власти Нью-Йорка боролись с вирусом. Гонорар Куомо составил 5,1 млн. долларов.

Фотографии стрижек йорков

стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йорка В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать
Стрижка йорка В наличии Заказать	йоркширский терьер «до» и «после» В наличии Заказать	йоркширский терьер «до» и «после» В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать
Стрижка йорка: до и после В наличии Заказать	Стрижка йорка: до и после В наличии Заказать	Стрижка йорка В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера В наличии Заказать	Стрижка йорка В наличии Заказать
Стрижка йорка В наличии Заказать	Стрижка йорка В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорка: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорка: ДО В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера: ДО В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ДО В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ДО В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йоркширского терьера: ДО В наличии Заказать	Стрижка йоркширского терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорк терьера: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорк терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорк терьера: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорк терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать
Стрижка йорк терьера: ДО В наличии Заказать	Стрижка йорк терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать	Стрижка йорк терьера: ДО В наличии Заказать
Стрижка йорк терьера: ПОСЛЕ В наличии Заказать

Фото стрижки и прически Йорка в салоне

В сети салонов для собак «Милорд» можно не только воспользоваться профессиональными услугами груминга для йоркширских терьеров, но и предварительно посмотреть фото возможных причесок для своего питомца. Благодаря особой структуре шерстки, напоминающей человеческий волос, йоркам подходят различные стрижки и типы укладок. Потому хозяевам бывает сложно выбрать образ для любимца. На данном сайте загружены картинки, показывающие, как будет выглядеть собака после обслуживания.

В практике груминга стрижки йорка делятся на три основные категории:

• гигиенические, когда убираются волоски в паху, на лапках и мордочке — чаще делаются щенкам и особям, регулярно гуляющим на улице;
• модельные или декоративные – прически, предполагающие разные варианты состригания шерсти по корпусу, на конечностях и голове. Их главной целью является подчеркивание красоты животного, они рекомендованы лишь взрослым йоркам;
• креативные – необычные и оригинальные стрижки, позволяющие сформировать яркий имидж питомца путем выстригания узоров, окрашивания шерсти, создания временных татуировок и пр.

Возможно отдельное настригание головы и окантовка лап.

Комплексный сервис

На фото можно увидеть, что представляет собой стандартная гигиеническая стрижка, а также стрижки «под пуделя», «под щенка», «под шиншиллу», в азиатском стиле и т.д. Следует отметить, что йоркширский терьер нуждается не только в стрижке, поэтому обслуживание у нас охватывает и:

• удаление колтунов;
• подстригание когтей, маникюр;
• очистку ушных раковин, глаз и зубов;
• борьбу с наружными паразитами;
• расслабляющие SPA-процедуры;
• наклеивание страз и др. декоративные услуги.

Всему этому предшествует купание и сушка йорка. Для мытья используется безвредная косметика итальянского бренда «MILORD» с ингредиентами, нежно очищающими шевелюру пса и придающими ей блеск и шелковистость. Наши мастера тщательно стерилизуют инструменты и применяют современное удобное оборудование, чтобы животные ощущали себя комфортно, не испытывали стресса. Беспокойство о здоровье четырехлапых клиентов включает и отказ от наркоза.

Бережная забота

Доверяя нам своего питомца, вы можете быть уверены в его безопасности и том, что он будет пострижен, как на фотографии, которая была избрана в качестве образца. При возникновении затруднений с подбором стрижки наш опытный специалист поможет советом, даст ценные рекомендации по уходу за йорком. Особенно полезными они станут для владельцев псов, принимающих участие в выставках. Салоны «Милорд» — это выбор любящих хозяев. Мы ждем вас ежедневно в Москве и других городах России!

В Нью-Йорке нашли доказательства домогательств экс-губернатора Куомо

https://ria.ru/20211122/domogatelstva-1760233425.html

В Нью-Йорке нашли доказательства домогательств экс-губернатора Куомо

В Нью-Йорке нашли доказательства домогательств экс-губернатора Куомо — РИА Новости, 22.11.2021

В Нью-Йорке нашли доказательства домогательств экс-губернатора Куомо

Ассамблея Нью-Йорка установила, что бывший губернатор Эндрю Куомо совершал сексуальные домогательства. РИА Новости, 22.11.2021

2021-11-22T19:13

2021-11-22T19:13

2021-11-22T19:19

в мире

сша

нью-йорк (город)

эндрю куомо (губернатор штата нью-йорк)

джо байден

нэнси пелоси

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/149606/70/1496067090_0:33:5260:2992_1920x0_80_0_0_d12173aa9df79c76b05e270447be9635.jpg

НЬЮ-ЙОРК, 22 ноя — РИА Новости. Ассамблея Нью-Йорка установила, что бывший губернатор Эндрю Куомо совершал сексуальные домогательства.»Мы пришли к выводу, что существуют значительные доказательств того, что бывший губернатор Куомо причастен к сексуальным домогательствам», — говорится в документе, подготовленном юристами от имени юридического комитета ассамблеи.Куомо лишился поста губернатора из-за обвинений в домогательствах, о которых заявили 11 женщин, работавших с ним в разные годы. Куомо, который сложил полномочия осенью, не признавал обвинений, заявляя, что атаки на него носят исключительно политическую подоплеку. Он также говорил, что его склонность к тактильным контактам была проявлением дружеского участия и лишена сексуального подтекста. Однако, перед женщинами Куомо все же извинился.К отставке Куомо призывали президент США Джо Байден, спикер палаты представителей Нэнси Пелоси, сенаторы от Нью-Йорка.

https://ria.ru/20210824/ssha-1746968465.html

сша

нью-йорк (город)

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/149606/70/1496067090_584:0:5260:3507_1920x0_80_0_0_50a120d84fad6a3c1b6def2d15b58843.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

в мире, сша, нью-йорк (город), эндрю куомо (губернатор штата нью-йорк), джо байден, нэнси пелоси

19:13 22.11.2021 (обновлено: 19:19 22.11.2021)

В Нью-Йорке нашли доказательства домогательств экс-губернатора Куомо

Новый интерьер дома по проекту Рихарда Нойтры

Случай Hailey Residence – редкий для жилого особняка с богатой историй. Дом, построенный американским модернистом Рихардом Нойтрой в 1959 году, не раз переходил из рук в руки, но ему повезло с владельцами – никто из них ни разу не устроил радикальной переделки здания. Удача не изменила особняку и несколько лет назад, когда его новым хозяином стал креативный директор Патрик О’Нилл, перебравшийся в Лос-Анджелес из Нью-Йорка специально, чтобы жить в этом доме. О’Нилл задался целью вернуть постройке аутентичный интерьер и поручил работу целой команде специалистов: декоратору Энтони Барсумяну, менеджеру Барбаре Лампрехт и реставрационной студии Andrew Gray. 

Фото: Douglas Friedman

Здание, расположенное в районе Hollywood Hills, установлено на склоне холма, а его просторная дощатая терраса буквально парит над садом. Строгим прямоугольным формам и ячеистым архитектурным элементам Барсумян противопоставил мебель с органическими формами: столик в форме почки дизайнера-модерниста Гилберта Рода, кожаный пуф DeSede, итальянские винтажные стол и стулья 1950-х годов, закругленный диван американского классика Владимира Кагана. 

Фото: Douglas FriedmanФото: Douglas Friedman

Уместными отсылками к эпохе постройки здания стали и редкая граненая тележка по дизайну Ико Паризи, и аудио-колонка по дизайну Чарльза и Рэй Имз, и плетеное уличное кресло Ханса Вегнера. Барсумян не просто сформировал убедительную композицию из разных элементов – он создал энциклопедию модернизма в рамках отдельно взятого интерьера. Как в любом хорошем модернистском доме, здесь много произведений искусства: на лаконичном фасаде камина укреплена бронзовая скульптура Тома Альстрема и Ханса Эрлиха, на стенах развешаны черно-белые фотографии и абстрактная графика.

Фото: Douglas FriedmanФото: Douglas Friedman

С почтением Барсумян отнесся и к палитре проекта. Огромной радостью для хозяина и декоратора стала отличная сохранность деревянных встроенных элементов. Медовому оттенку кухонных шкафов Барсумян противопоставил черную окраску пробочного пола, новые раздвижные створки из черного стекла и прохладный серый цвет стен. Уникальность кухне придают фартук и столешница из желто-зеленого ламината, спроектированные самим Нойтрой, и отреставрированная печь Thermador. Сохранился даже обаятельный встроенный в стену телевизор, который снова работает – на радость хозяину дома. 

Фото: Douglas FriedmanФото: Douglas Friedman

как католики встретили Рождество. Фоторепортаж — РБК

В этом году не все католики и протестанты смогли встретиться с родными и близкими, собраться за одним столом, посетить мессу в церкви на Рождество. Но, несмотря на ограничения и трудности, люди по всему миру встретили семейный праздник: в масках, соблюдая дистанцию, на открытом воздухе и общаясь через стекло. Как в разных частях света отметили Рождество — в фоторепортаже РБК

Фото: Guglielmo Mangiapane / Reuters

Площадь Святого Петра во время рождественской мессы. Рим, Италия

Фото: Vatican Media / Handout via Reuters

Папа римский Франциск проводит рождественскую мессу, в которой из-за ограничений приняли участие лишь немногие верующие. Базилика Святого Петра, Ватикан

Фото: Mike Segar / Reuters

Четырехлетняя Райли, шестилетний Майкл и их мать Кристина навещают в канун Рождества свою прабабушку Лоррейн в реабилитационном центре для пожилых людей Толстовского фонда. Штат Нью-Йорк, США

Фото: Tony Hicks / AP

Жители Лондона Ник и Чарли разговаривают с родственниками по телефону во время завтрака на Трафальгарской площади 25 декабря. Пара решила пообедать на свежем воздухе после того, как их запланированная поездка к семье была отменена из-за ограничений

Фото: Михаил Терещенко / ТАСС

Прихожане во время рождественской мессы в Римско-католическом кафедральном соборе Непорочного Зачатия Пресвятой Девы Марии. Москва, Россия

Фото: Chung Sung-Jun / Getty Images

Во время онлайн-рождественской службы в Церкви Полного Евангелия Ёыйдо в Сеуле, Южная Корея

Фото: Jose Luis Gonzalez / Reuters

Дети в ожидании подарков, собранных в виде пожертвований пожарной службой в Сьюдад-Хуаресе, Мексика

Фото: Susana Vera / Reuters

Семьи с низким доходом стоят в очереди за едой, выдаваемой неправительственной организацией Madrina Foundation во время вспышки коронавирусной инфекции в Мадриде, Испания

Фото: Ulet Ifansasti / Getty Images

Рождественская месса в церкви Иммануила в Джакарте, Индонезия

Фото: Sergio Moraes / Reuters

Семья празднует канун Рождества на своем балконе в Рио-де-Жанейро, Бразилия

Фото: Hristo Rusev / Getty Images

Сиделка Сильвия Димитрова дарит рождественские подарки врачам и пациентам в отделении интенсивной терапии Александровской больницы в Софии, Болгария

Фото: Loren Elliott / Reuters

Рождество на пляже Бонди в Сиднее, Австралия

Фото: Amit Dave / Reuters

Женщина измеряет температуру у прибывших на мессу во время празднования Рождества в Ахмадабаде, Индия

Пиометра у собак: симптомы и лечение, фото

Пиометра у собак – это воспаление матки, при которой в её полости скапливаются гнойные выделения. Как правило, пиометра у собаки развивается вскоре после течки, когда в организме нарастает уровень гормона прогестерона. Чаще встречается у собак старше 5-6 лет.

Риск возникновения данной болезни увеличивается, если животному давали препараты на основе эстрогена с целью контрацепции.

Причины развития пиометры у собак

Основным пусковым механизмом является изменение гормонального фона у животного – повышение уровня прогестерона. Прогестерон – это гормон, который вырабатывается в яичниках. Он отвечает за подготовку слизистой оболочки матки у собаки к беременности, активизирует работу внутриматочных желез.

При повышении уровня прогестерона железы увеличиваются в размерах и начинают интенсивно вырабатывать слизь. Прием эстрогенов усугубляет эту ситуацию, так как повышает чувствительность слизистой оболочки матки к прогестерону.

Под воздействием прогестерона в матке происходит снижение местного иммунитета. В результате может развиться инфекционный процесс. Причем в роли возбудителей выступают микроорганизмы, которые постоянно присутствуют в организме животного (условно патогенная микрофлора), но не приводят к развитию заболеваний. Чаще всего гнойный процесс в матке при развитии пиометры у собак вызывается кишечной палочкой.

Повышенное содержание слизи, которая образуется в матке у собаки под воздействием прогестерона, создает условия для быстрого развития инфекционного процесса. Кроме того, избыток прогестерона приводит к тому, что канал шейки матки закрывается. В результате нарушается отток слизи и гноя из пораженного органа.

По мере развития воспалительного процесса гной скапливается в полости матки. Токсины начинают всасываться в кровь, вызывая общую системную ответную реакцию организма. Интенсивно образующиеся выделения способствуют нарастанию внутриматочного давления. Болезненные ощущения в нижней части брюшной полости приводят к затруднению дыхания у собаки. В результате ухудшается газообмен в легких, интоксикация нарастает.

Если животному вовремя не оказать помощь, то прогрессирующее течение пиометры у собак может привести к разрыву матки, развитию перитонита (воспаления брюшины) и гибели животного. Также причиной смерти собаки может стать перегрузка организма токсинами и нарушение работы жизненно важных органов.

Виды пиометры у собак

Специалисты выделяют две формы течения пиометры у собак – открытую и закрытую. При остром развитии процесса чаще всего развивается закрытая форма. Для этого вида характерно нарушение оттока слизи и гноя из полости матки, приводящее к тяжелому течению заболевания.

Иногда воспаление слизистой оболочки матки у собак носит хронический характер. В этом случае, как правило, не происходит закрытие канала шейки матки, и, таким образом, не нарушается отток отделяемого из органа. Открытая форма пиометры у собак имеет более легкое течение и лучше поддается терапии.

Симптомы пиометры у собак

При закрытой форме пиометры у собак болезнь, как правило, начинается остро. Появляются симптомы, связанные с общей реакцией организма на воспалительный процесс – собака начинает отказываться от еды, становится вялой, сонливой. Собака начинает много пить, часто мочится. Возникает лихорадка – температура может достигать 40°С и выше. Нередко наблюдается рвота, усугубляющая состояние обезвоживания.

Кроме того, начинают нарастать местные признаки воспаления – появляется вздутие, болезненность живота в области матки, напряжение мышечной стенки.

При открытой пиометре у собак общие признаки выражены умеренно –незначительное повышение температуры, снижение аппетита. Основным признаком признаком пиометры у собак считаются выделения из влагалища – как правило, гнойные, с неприятным запахом.

Диагностика пиометры у собак

Залогом успешного лечения пиометры у собак является своевременная диагностика. В то же время на начальной стадии развитии болезни поставить диагноз бывает затруднительно, так как в течении преобладают общие признаки. Именно поэтому при первых признаках ухудшения состояния животного необходимо обратиться к высококвалифицированному специалисту.

Одним из ключевых методов диагностики пиометры у собак является ультразвуковое обследование. УЗИ собаке в ветеринарном центре Прайд специалисты проведут на ультразвуковом аппарате экспертного класса Mindrey DC-7. Тщательное обследование, анализы с использованием ресурсов современнейшей лаборатории – все это поможет быстро и точно установить диагноз и начать лечение.

Пиометра у собаки

Лечение пиометры у собак

Основным методом лечения пиометры у собак, особенно если речь идет о закрытой форме, является оперативное вмешательство – удаление матки и яичников. При открытой форме пиометры у собак лечение может быть ограничено медикаментозной терапией.

Важную роль играют терапевтические мероприятия, направленные на снижение токсической нагрузки на органы, при которых пиометру у собак лечат медикаментозно. Лечение должно проводиться только специалистом высокой квалификации, который сможет грамотно подобрать тактику и помочь животному вновь обрести здоровье.

Профилактика пиометры

Для снижения риска развития пиометры у собак рекомендуется избегать применения препаратов на основе эстрогена, а также регулярно проводить контроль гормонального фона у собак зрелого возраста для своевременного выявления тенденции к повышению уровня прогестерона в организме.

Наши пациенты после пиометры

11,5-летняя собака породы йоркширский терьер Тиффани поступила на прием в ветеринарный центр Прайд к терапевту в состоянии угнетения, отказа от еды, повышенной жажды.

При осмотре были обнаружены гнойные выделения из влагалища. Проведена ультразвуковая диагностика и установлен диагноз пиометра — гнойное воспаление матки, в данном случае с угрозой ее разрыва.

Было принято решение об оперативном лечении в короткие сроки. Выполнено преднаркозное обследование, процедуры, подготавливающие к операции. Собака благополучно прооперирована хирургом Масловой Е.С. В данный момент проходит послеоперационное лечение в условиях стационара.

 

Живое изображение эндотелиальной активности Erk выявляет динамические и последовательные сигнальные события во время регенеративного ангиогенеза

Существенные изменения:

1. Очень любопытно, что активация ERK наблюдается у соседних ISV после травмы. Насколько далеко распространяется активация ERK от места повреждения? Наблюдается ли это у независимых поставщиков программного обеспечения, которые находятся дальше от места раны?

Это отличный вопрос, и мы предоставили более подробный анализ в ответ на этот вопрос.Мы сгенерировали данные, охватывающие большее поле зрения, чем предыдущие анализы, чтобы мы могли количественно оценить реакцию передачи сигналов Erk дальше от удаленного сосуда. Мы измерили ответ на соседних ISV, 2 и 3 на удалении от абляции (в переднем направлении на эмбрионе — см. Рисунок 3 — приложение к рисунку 1A ). Мы обнаружили, что, хотя реакция непосредственно примыкающего судна всегда стабильна, судно 2 ^nd показывает очень небольшую активацию Erk, а судно 3 ^rd — нет.Все эти новые данные теперь включены с тщательной количественной оценкой в ​​пересмотренный Рисунок 3 — дополнение к рисунку 1.

Основываясь на этих новых наблюдениях, реакция в основном происходит на непосредственно раненом судне и непосредственно прилегающем к нему судне. Дальше мало доказательств для ответа.

2. Аргумент в пользу роли передачи сигналов Vegfr в ​​продвижении текущей активности Erk основан исключительно на результатах лечения SU5416. Химические ингибиторы могут иметь неспецифические эффекты, а SU5416 может также блокировать другие рецепторные тирозинкиназы.Важно подтвердить эти результаты, используя методы генетического мутанта или нокдауна. Частичный нокдаун мутантов vegfaa и kdr или kdrl, которые будут иметь частичные дефекты прорастания ISV, можно использовать для подтверждения результатов, полученных с использованием химического ингибитора.

Мы согласны с рецензентом в том, что генетическая модель необходима для обеспечения дополнительной уверенности в фармакологических данных. В ответ на это мы предоставляем существенные новые данные.

Здесь мы попробовали несколько различных генетических подходов, но решили ответить на этот вопрос с помощью модели kdrl Crispant.Причина этого заключается в том, что у нас не было мутантной линии, доступной без продленного периода для импорта, и было обнаружено, что Crispant очень надежно фенокопирует ранее опубликованный MO и мутантный фенотип (см. Новый Рисунок 5 — приложение к рисунку 1K, L ) ( Habeck et al., 2002; Covassin et al., 2006).

Мы создали kdrl Crispants, а затем протестировали сигнальный ответ Erk на ранение при 3 гПа. Мы обнаружили, что потеря kdrl явно снижает уровни передачи сигналов Erk (см. Новый Рисунок 5B и Рисунок 5, приложение 1M-T ‘), хотя и не в такой степени, как ингибиторы пан-VEGFR (см. Рисунок 5A ). .Это неудивительно, поскольку вполне вероятно, что Kdr или Flt4 также могут играть роль в этом ответе (Covassin et al., 2006; Shin et al., 2016). Мы также добавили дополнительный пояснительный текст вокруг этих данных и точки (см. стр. 11, строки 342–350 и страницы 24,25, строки 130–155 ).

3. Авторы предполагают, что VEGF, секретируемый макрофагами, ответственен за продолжение активации ERK при 3 гПа. Это должно быть проверено непосредственно путем ингибирования макрофагов с использованием метода spi1b и csf3r MO

Мы благодарим рецензента за это предложение и добавляем новые важные данные в ответ.Мы использовали тот же подход МО для подавления макрофагов в эмбрионе и определения влияния на (1) регенерацию сосудов при 24 гп и (2) передачу сигналов Erk при 3 гПа.

Нам удалось самостоятельно воспроизвести работу Гуревича и др. 2018, демонстрируя, что регенерация сосудов снижалась в отсутствие макрофагов (см. Новые данные в Рисунок 3 —, приложение к рисунку 2H-J) (Gurevich et al., 2018). Это и прямая визуализация макрофагов у эмбрионов с нокдауном MO (Рисунок 3 — приложение к рисунку 2E-G ) подтвердили, что модель работает для дополнительного анализа.

Затем мы измерили передачу сигналов Erk, используя линию EKC. Мы обнаружили, что удаленные ECs ISV сохраняли свою активность Erk на уровне 3 гПа в отсутствие макрофагов (см. Новые данные в Рисунок 5D и Рисунок 5 — рисунок в приложении 2). Это указывает на то, что хотя макрофаги необходимы для регенерации сосудов, они не являются единственным источником Vegfs при 3 гПа, и, вероятно, существуют другие местные источники. Мы также добавили дополнительный пояснительный текст вокруг этих данных и точки (см. Стр. 11, строки 357–360; стр. 15, строки 493–495; стр. 48, 688–689 ).

Эти новые результаты побудили нас немного пересмотреть нашу окончательную модель того, как этот механизм работает на исправленном Рисунке 7.

4. Линия 396, чтобы задать потребность в сигнале Ca ²⁺ для второй активности ERK при 3 гПа, авторы обработали ампутированные эмбрионы NF между 2,5 гПа и 3 гПа. Было бы важно определить, является ли Ca ²⁺ между 0 гПа и 15 МПа важным для устойчивого сигнала ERK при 3 гПа. Может ли автор лечить ампутированный эмбрион NF между 0 и 15 МПа и измерять активность ERK в удаленных ЭК при 3 гПа?

Мы выполнили эти эксперименты и обнаружили, что потеря передачи сигналов Ca ²⁺ из-за обработки нифедипином от 0 до 30 мПа недостаточна, чтобы повлиять на уровень передачи сигналов Erk на более поздних стадиях (см. Новые данные в , рис. 6F). и Рисунок 6 — дополнение к рисунку 2H-N ‘).

Мы не уверены, что именно это говорит нам о функциональном значении раннего Ca ²⁺ зависимого всплеска Erk, потому что его роль может быть более тонкой, чем предполагает это измерение.

Тем не менее, мы считаем, что это полезное дополнение к рукописи, и теперь мы включаем эти новые данные в исправленный Рисунок 6F. Мы также добавили дополнительный пояснительный текст вокруг этих данных и точки (см. Стр. 13, Строки 427-429; Стр. 24, Строки 122-126 ).

5. Согласно фиг. 2 концевые клетки показывают асимметричную активность ERK после деления клеток. Могут ли авт. Использовать репортер ERK, чтобы подтвердить существующее предположение, что ERK ингибирование сигнала Notch в стеблевых клетках опосредуется соседними концевыми клетками после их асимметричного клеточного деления. DAPT может быть полезен для измерения последовательной активности ERK в клетках кончика и ножки после деления клетки.

К сожалению, мы не смогли провести этот эксперимент во время повторного представления по чисто логистическим причинам.

Запрошенный эксперимент требует высокоскоростной микроскопии вращающегося диска. Наша лаборатория недавно переехала, и мы начали покупку конфокального микроскопа с вращающимся диском, эквивалентного тому, который использовался для получения большей части данных в статье. Однако наша покупка была заморожена в начале 2020 года из-за воздействия COVID-19. Это означало, что нам нужно было учесть озабоченность рецензентов в связи с отсутствием возможности высокоскоростной визуализации, которую мы использовали для большей части первоначальной подачи (когда у нас ранее был доступ к системе Andor Dragonfly).

Запрошенный эксперимент по изучению динамики асимметричной передачи сигналов Erk после деления концевых клеток является хорошей идеей. Однако мы не думаем, что этот эксперимент каким-либо образом меняет выводы настоящего исследования. Это привело бы к очень подробному анализу механизма, который мы не исследовали в первоначальной версии рукописи. Таким образом, и учитывая причины нашей задержки здесь, мы надеемся, что рецензенты и редакторы сочтут этот запрос продолжением текущего исследования и поймут наши причины, по которым мы его не предоставили.

Нам определенно хотелось бы провести этот эксперимент, и если рецензенты сочтут его абсолютно необходимым для принятия статьи, мы все еще сможем это сделать, как только наш новый микроскоп (наконец) появится через несколько месяцев (середина 2021 года).

6. Пожалуйста, обсудите, как увеличивается количество Ca ²⁺ в эндотелиальных клетках, ссылаясь на предыдущие исследования TRP-каналов или рецепторов P2X.

Мы расширили обсуждение на странице 15, включив в него обсуждение того, как TRP-каналы или рецепторы P2X могут играть роль в этом процессе, и процитировали 2 соответствующих обзора.Мы думаем, что это хорошая точка зрения рецензента и улучшает обсуждение, но мы не вдавались в подробное обсуждение этого потенциального механизма, поскольку у нас нет данных в документе, которые напрямую относятся к TRP или функции P2X4-7 в данио EC Ca ²⁺ сигнализация (см. стр. 16, строки 511-515 ).

https://doi.org/10.7554/eLife.62196.sa2

Живое изображение эндотелиальной активности Erk выявляет динамические и последовательные сигнальные события во время регенеративного ангиогенеза

Рисунок 5.. Активность Erk в удаленных сосудах поддерживается посредством пути Vegfr.

Рисунок 5. Активность Erk в удаленных сосудах поддерживается посредством пути Vegfr.

( A ) Постоянная передача сигналов Erk требует активности Vegfr и Mek. Количественная оценка интенсивности ядерной ЭКК после / до абляции через 3 часа после абляции (гПа) в эндотелиальных клетках (ЭК) обработанных 0,5% диметилсульфоксидом (ДМСО) неаблированных контрольных ISV (33 ЭК, n = 11 личинок) и удаленные ISV личинок, обработанных либо 0.5% ДМСО (51 ЭК, n = 17 личинок), 15 мкМ SL327 (42 ЭК, n = 14 личинок), 4 мкМ SU5416 (47 ЭК, n = 16 личинок) или 10 мкМ SU5416 (32 ЭК, n = 11 личинки). ( B ) Kdrl необходим для полной индукции активности Erk в удаленных ISV EC. Количественная оценка пост- / преабляционной интенсивности ядерных ЭКК 3 гПа в неаблированных контрольных ЭК ISV для неинъектированного контроля (27 ЭК, n = 9 личинок) и kdrl криспантов (26 ЭК, n = 9 личинок) и удаленных ISV ЭК неинъектированного контроля (22 ЭК, n = 8 личинок) и кДРЛ криспантов (27 ЭК, n = 9 личинок).( C ) Количественная оценка горизонтальной длины ISV (в процентах от контроля) для удаленных ISV через 24 ч / г, 5 дней после оплодотворения (dpf), личинки EC-EKC, обработанные 0,5% ДМСО (n = 18 личинок), 4 мкМ SU5416 (n = 12 личинок), 15 мкМ SL327 (n = 15 личинок) или 1 мкМ траметиниба (n = 13 личинок). ( D ) Макрофаги не требуются для поддержания активности Erk в удаленных ISV EC. Количественная оценка интенсивности ядерных ЭКК после / преабляции 3 гПа в неаблированных контрольных ЭК ISV неинъектированного контроля (24 ЭК, n = 8 личинок) и spi1 / csf3r морфантов (21 ЭК, n = 7 личинок), и удалили ECs ISV неинъектированного контроля (29 EC, n = 10 личинок) и spi1 / csf3r морфантов (31 EC, n = 11 личинок).( E – G ) Конфокальные изображения бокового вращающегося диска аблированных ECs ISV у личинок EC-EKC с 4 dpf, 3 hpa, обработанных 0,5% ДМСО ( E ), 4 мкМ SU5416 ( F ) или 10 мкМ SU5416 ( G ). Активность EC Erk была постоянно выше и более Vegfr-зависимой ближе к ране. Стрелки указывают первый (белый), второй (желтый) и третий (зеленый) ЭК от места ранения. Полные изображения: Рисунок 5 — дополнение к рисунку 1D ’, H’, J ’. ( H ) Количественная оценка интенсивности ядерных ЭКК после / преабляции при 3 гПа в первом (темно-серый), втором (красный) и третьем (голубой) ЭК из раны.Обработкой были 0,5% обработанные ДМСО неаблированные контрольные ISV (11 первых, вторых и третьих ЭК, n = 11 личинок) и удаленные ISV личинок, обработанных либо 0,5% ДМСО (17 первых, вторых и третьих ЭК, n = 11 личинок). = 17 личинок), 4 мкМ SU5416 (16 первых и вторых ЭК и 15 третьих ЭК, n = 16 личинок) или 10 мкМ SU5416 (11 первых и вторых ЭК и 10 третьих ЭК, n = 11 личинок). Эти же эмбрионы использовались в ( A ). ( I ) Количественная оценка интенсивности ядерных ЭКК после / преабляции при 3 гПа в первом (14 ЭК, n = 14 личинок), втором (14 ЭК, n = 14 личинок), третьем (14 ЭК, n = 14 larvae), четвертый (11 ЭК, n = 11 личинок) и пятый (8 ЭК, n = 8 личинок) ЭК из раненого участка удаленных ISV у 4 личинок EC-EKC dpf.Данные для первого, второго и третьего ЭК были взяты из рисунка 4 — приложение к рисунку 1N. ISV: межсегментарный сосуд; DA: дорсальная аорта. Статистический тест: тест Краскела-Уоллиса проводился для графиков ( A, C, D, H, I ). Обычный односторонний тест ANOVA был проведен для графика ( B ). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. 15 мкм для изображения ( E ).

Erk, первая оппозиционная партия Узбекистана, заявляет, что попытается выставить кандидата в президенты

ТАШКЕНТ. Узбекская партия «Эрк» (свобода), запрещенная в 1990-х годах, а ее лидер изгнан из страны, а его соратники заключены в тюрьму, заявляет, что планирует попытаться выставить кандидата в президенты на выборах в конце этого года.

Согласно заявлению партии от 5 апреля, два члена партии, Саловат Умрзоков и Джахонгир Отаджонов, официально заявили о своем намерении попытаться стать кандидатом партии на выборах.

Он добавил, что позже ЦК партии решит, кто из кандидатов будет официально выдвинут на голосование, которое намечено на 24 октября.

«Демократическая партия« Эрк », которая в течение 30 лет вела свою деятельность под давлением и преследованиями с тех пор, как стала первой в Узбекистане независимой политической партией, официально зарегистрированной в Министерстве юстиции в 1991 году, решила выдвинуть своего кандидата на предстоящее заседание. президентские выборы «, — говорится в заявлении партии.

В январе 2020 года Министерство юстиции Узбекистана отказалось официально перерегистрировать партию, а министр юстиции Русланбек Давлетов тогда заявил, что «Эрк» «остался в прошлом» и не может возобновить свою деятельность. Маловероятно, что Эрк получит возможность официально баллотироваться на октябрьских выборах.

Известный узбекский поэт Мухаммад Солих, основавший партию, был единственным соперником президенту Исламу Каримову на первых постсоветских выборах в этой центральноазиатской стране в 1991 году.

Независимые наблюдатели заявили в то время, что около 50 процентов избирателей поддержали Солиха, но официальные результаты показали, что он получил только 12 процентов голосов.

Официальные лица на выборах объявили Каримова победителем, что вызвало жестокую разгону студенческой демонстрации. Число погибших студентов пока неизвестно. После репрессий все оппозиционные газеты были закрыты, и были начаты расследования против лидеров оппозиции, которым пришлось бежать из страны.

Солих бежал из Узбекистана в Азербайджан в 1993 году, а затем поселился в Турции, где и проживает с тех пор.

Каримов умер в 2016 году, а его преемник, президент Шавкат Мирзиёев, освобождает политических заключенных в рамках политики постепенного снижения авторитарного контроля в округе.

Мирзиёев с тех пор позиционирует себя как реформатор, открывающий свою страну для своих соседей и внешнего мира, хотя многие активисты говорят, что изменения еще не зашли достаточно далеко.

Хотя Мирзиёев сказал, что он не против наличия оппозиционных политических групп в Узбекистане, подлинным оппозиционным партиям было практически невозможно пройти регистрацию с момента обретения страной независимости в конце 1991 года.

На прошлой неделе, за шесть месяцев до выборов и в связи с ростом числа физических нападений на критиков правительства, правительство объявило уголовным преступлением «оскорбление и клевету» на президента в цифровой и онлайн-форме.

Критики говорят, что этот шаг направлен на то, чтобы заткнуть рот блогерам и другим людям перед выборами.

Требуются дополнительные материалы для производства «Эрк»

Южный университет Джорджии приглашает фанатов принять участие в новом крупном фильме под названием «Эрк». Сцены для фильма о жизни легендарного главного футбольного тренера Иглз Эрика Рассела будут записаны в субботу, 13 апреля, в 13:00. во время весеннего футбольного матча Blue White на стадионе Полсона. Создатели фильма будут снимать фанатов крупным планом и толпой.
Поклонников Джорджии Саутерн просят одеться в одежду периода 1980-х, чтобы делать точные кадры и иметь шанс сняться в фильме.«Мы хотим передать сущность стадиона« Полсон », каким он был в 1984 году», — сказал продюсер «Эрк» и выпускник из Южной Джорджии Бо Турпин. «Мы настоятельно призываем всех выйти на улицу в костюмах фанатов американского футбола середины 1980-х годов. В дополнение к одежде также приветствуются длинные волосы, которые были популярны у женщин в 80-х годах ».
Турпин предостерегает фанатов, чтобы они не перестарались. «Стейтсборо был маленьким городком с новыми поклонниками, когда программа только зарождалась, — пояснил он. «Чем проще, тем лучше. Мы будем раздавать знаки толпе.Приветствуются молочные кувшины и самодельные шумоглушители. Важным моментом является то, что мы поддерживаем «Орлов 2013» за игру «Сине-белые» ».
Турпин также сказал, что создатели фильма будут на заднем плане и не будут прерывать игру, но они могут поговорить с толпой, чтобы получить конкретные кадры. Полное производство «Эрк» начнется в конце этого года
Перед игрой Eagles проведут лагерь Little Eagles в 11 утра. Лагерь бесплатный и открыт для всех детей в возрасте от 4 до 12. После игры в 7 p.м., Ассоциация выпускников футбола Eagle Football проведет обратный розыгрыш $ 10 000. Билеты по-прежнему можно приобрести, связавшись с Фондом легкой атлетики по телефону 912-478-5520.
Бейсбольная команда Джорджии Саутерн, софтбол, мужской футбол и мужской теннис также будут выступать в эти выходные. Бейсбол проведет серию из трех игр на выходных против «Цитадели», в то время как софтбол проведет сет из трех игр против «Сэмфорд Буллдогс». Мужская теннисная команда встретится с Самфордом в пятницу и Чаттанугой в субботу.Оба матча начнутся в полдень, а суббота станет старшим днём. В воскресенье в мужском футболе пройдет двукратный весенний футбол. Первый матч против Северной Флориды запланирован на 13:00. а второй против SCAD установлен на 17:00.

Применение в антифибротической фототерапии — Университет Кюсю

TY — JOUR

T1 — Фотопродукт триптофана FICZ стимулирует AHR / MEK / ERK-опосредованную экспрессию MMP1

T2 — Значение в антифибротической фототерапии

, Mika

AU — Ямамура, Kazuhiko

AU — Hashimoto-Hachiya, Akiko

AU — Tsuji, Gaku

AU — Furue, Masutaka

AU — Mitoma, Chikage N1000 — Информация о финансировании Эта работа была частично поддержана грантом (h37-Shokuhin-Shitei-017) на исследования по безопасности пищевых продуктов Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии.

PY — 2018/7

Y1 — 2018/7

N2 — Предпосылки: склеродермия вызывается аберрантной передачей сигналов трансформирующего фактора роста β. Распад белков внеклеточного матрикса регулируется матриксными металлопротеиназами (ММП) и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Ультрафиолетовое (УФ) излучение было средством лечения склеродермии. 6-Формилиндоло [3,2-b] карбазол (FICZ), лиганд эндогенного арилуглеводородного рецептора (AHR), представляет собой метаболит триптофана, образующийся под воздействием УФ-излучения.Тем не менее, не исследовалось, регулирует ли FICZ MMP и TIMP. Цель: выяснить регуляторную роль FICZ в экспрессии MMP и TIMP в нормальных фибробластах кожи человека (NHDF). Методы. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени была проведена для определения экспрессии MMP или TIMP в NHDF, обработанных FICZ или UVB. Уровни ММП измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Действие FICZ на MMP анализировали с использованием AHR-нокдауна NHDF или селективных ингибиторов митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK).Фосфорилирование протеинкиназы, связанной с микротрубочками (MEK), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Результаты: UVB увеличивал уровни мРНК и белка MMP1 и MMP3 в NHDF, тогда как FICZ усиливал уровни MMP1, но не MMP3. Воздействие FICZ на TIMP было незначительным. FICZ увеличивал экспрессию MMP1 AHR-зависимым образом. Индуцированная FICZ повышающая регуляция MMP1 улучшалась с помощью ингибиторов MEK / ERK, тогда как эффекты UVB отменялись с помощью N-концевой киназы c-Jun (JNK) и p38-MAPK, а также ингибиторов MEK / ERK.Фосфорилирование ERK, индуцированное FICZ, зависит от AHR. Заключение: FICZ способствует УФ-опосредованным антифиброзным эффектам через сигнальный путь AHR / MEK / ERK в NHDF. FICZ — потенциальное терапевтическое средство от склеродермии.

AB — Предпосылки: склеродермия вызывается аберрантной передачей сигналов трансформирующего фактора роста β. Распад белков внеклеточного матрикса регулируется матриксными металлопротеиназами (ММП) и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Ультрафиолетовое (УФ) излучение было средством лечения склеродермии.6-Формилиндоло [3,2-b] карбазол (FICZ), лиганд эндогенного арилуглеводородного рецептора (AHR), представляет собой метаболит триптофана, образующийся под воздействием УФ-излучения. Тем не менее, не исследовалось, регулирует ли FICZ MMP и TIMP. Цель: выяснить регуляторную роль FICZ в экспрессии MMP и TIMP в нормальных фибробластах кожи человека (NHDF). Методы. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени была проведена для определения экспрессии MMP или TIMP в NHDF, обработанных FICZ или UVB.Уровни ММП измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Действие FICZ на MMP анализировали с использованием AHR-нокдауна NHDF или селективных ингибиторов митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK). Фосфорилирование протеинкиназы, связанной с микротрубочками (MEK), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Результаты: UVB увеличивал уровни мРНК и белка MMP1 и MMP3 в NHDF, тогда как FICZ усиливал уровни MMP1, но не MMP3. Воздействие FICZ на TIMP было незначительным.FICZ увеличивал экспрессию MMP1 AHR-зависимым образом. Индуцированная FICZ повышающая регуляция MMP1 улучшалась с помощью ингибиторов MEK / ERK, тогда как эффекты UVB отменялись с помощью N-концевой киназы c-Jun (JNK) и p38-MAPK, а также ингибиторов MEK / ERK. Фосфорилирование ERK, индуцированное FICZ, зависит от AHR. Заключение: FICZ способствует УФ-опосредованным антифиброзным эффектам через сигнальный путь AHR / MEK / ERK в NHDF. FICZ — потенциальное терапевтическое средство от склеродермии.

UR — http: // www.scopus.com/inward/record.url?scp=85046165385&partnerID=8YFLogxK

UR — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=85046165385&partnerID=8YFLogxK

9.100003 j2. 2018.04.010

DO — 10.1016 / j.jdermsci.2018.04.010

M3 — Артикул

C2 — 29703420

AN — SCOPUS: 85046165385

VL — 91

SP — 97

EP — JO — Journal of Dermatological Science

JF — Journal of Dermatological Science

SN — 0923-1811

IS — 1

ER —

Ketels, фото Erk — Charles F.Похоронное бюро и крематорий Снайдера

Предлагает похоронные услуги в Ланкастере, штат Пенсильвания, более 70 лет.

Наши пять похоронных бюро в округе Ланкастер позволяют легко и удобно организовать мероприятия и организовать услуги недалеко от дома.

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера в центре Ланкастера
• 414 Ист Кинг Стрит
• 717-393-9661
• Чарльз Ф. (Чип) Снайдер-младшийПохоронный директор / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера Лититц Пайк
• 3110 Лититц Пайк
• 717-560-5100
• Чарльз Ф. (Чад) Снайдер, III похоронный директор / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера Миллерсвилл
• 441 North George St.
• 717-872-5041
• Марк Д. Буркхолдер Директор по похоронам / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро семьи Шпахт-Снайдер, Лититц, Пенсильвания,
• 127 South Broad St.
• 717-626-2317
• Жаклин Адамсон Директор по похоронам / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро и крематорий Бахмана-Снайдера Страсбург, Пенсильвания
• ул. Южного Декейтера, 7,
• 717-687-7644
• Норман Т.Mable Похоронный директор / супервайзер
• подробнее

Фоточувствительные аналоги тирозина раскрывают сайт-зависимое фосфорилирование в TrkA, инициированное передачей сигналов MAPK / ERK

Сайт-специфическое включение ONB и AzF в TrkA-Y490

Чтобы установить сайт-специфическое включение ONB и AzF (рис. 1a) в TrkA, мы сначала сконструировали рецептор TrkA (wt), меченный EGFP, и рецептор TrkA с мутацией янтарного кодона (Y490amb) (рис.1b), чтобы обнаружить их экспрессию в клетках млекопитающих с помощью флуоресцентного сигнала. На основе этой версии wt в положение Y490 была введена мутация янтаря (UAG) для генерации TrkA (490amb). При совместной экспрессии TrkA (490amb) с плазмидой, кодирующей pONBYRS / U6-PyltRNA ²⁹ , ортогональной ONB (фиг.1c), или плазмидой, кодирующей AzF-RS / Bst-tRNA _CUA ³¹ , ортогональной AzF ( Рис. 1d) в присутствии 1 мМ Uaa в клеточной среде можно наблюдать флуоресцентные сигналы, что свидетельствует об успешном включении ONB или AzF в каждом состоянии.Эту конструкцию AzF-RS / Bst-тРНК _CUA сравнивали с плазмидами, отдельно кодирующими Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr , показывая аналогичные уровни экспрессии, количественно определяемые двойным репортером EGFP-mCherry ³¹ (Дополнительный рис. 1). В отсутствие AzF наблюдается минимальный уровень флуоресцентного сигнала, что позволяет предположить, что Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr ортогональны как в клетках HEK293T, так и в PC12 с минимальным уровнем ошибочного включения в стоп кодон.

Рис. 1: Включение ONB и AzF в TrkA.

а Структура ONB и AzF. b Схематическая диаграмма сконструированного рецептора TrkA, меченного EGFP на C-члене. Полноразмерный рецептор wt-TrkA состоит из внеклеточного домена (ECD), трансмембранного домена (TM), внутриклеточного домена (iTrkA) и EGFP. TrkA (Y490amb) имеет янтарную мутацию (UAG), введенную в позицию Y490 в домене iTrkA. c , d Флуоресцентные изображения живых клеток, котрансфицированных RS / тРНК _4x на одном сайте из тирозинкиназного домена Y490, в присутствии (+) или отсутствии (-) 1 мМ AzF ( c ) и 1 мМ ONB ( d ).

Чтобы количественно оценить уровень экспрессии TrkA-EGFP, мы сначала установили процедуру количественной оценки с использованием регулярной растворимой репортерной конструкции EGFPamb ³¹ , которая дает полноразмерный экспрессирующий белок только тогда, когда янтарная мутация в положении Y39 подавлена ​​(дополнительный рис. 2a), при этом 44% клеток, котрансфицированных EGFPamb и AzF-RS / Bst-tRNA _CUA , проявляют флуоресценцию при добавлении AzF, по сравнению со 100% клеток, трансфицированных EGFP дикого типа. В TrkA (490amb) -EGFP их было 52.6% клеток проявляют флуоресценцию при добавлении AzF по сравнению со 100% клеток, трансфицированных TrkA-EGFP (рис. 1d и дополнительная таблица 1), что указывает на значительный выход мембранного рецептора TrkA-EGFP, который сопоставим с водой -растворимый EGFP.

Использование клеток HEK293T для сайт-зависимой активации TrkA ERK

Связывание NGF с TrkA индуцирует сигнальные каскады AKT или MAPK / ERK, и сайт Y490 был связан с этими двумя путями, что было установлено масс-спектрометрическим анализом ¹⁸ (фиг. .2а). Чтобы определить TrkA-зависимые активации пути, мы исследовали эндогенную активацию TrkA MAPK / ERK в клеточных линиях HEK293T и PC12. Клетки HEK293 являются популярными клетками-хозяевами для экспрессии генов и анализа экспрессируемого белка из-за его переносимости различными методами. Для сравнения, клетки PC12 полезны в качестве модельной системы для дифференцировки нейронов NGF и нейросекреции. Мы определили активацию MAPK / ERK с помощью иммуноблот-анализа фосфорилированных ERK (p-ERK1 / 2, Thr202 и Tyr204), фосфорилированных Akt и фосфорилированных creb (p-creb, Ser133) (рис.2б). В обоих случаях клетки HEK293T и клетки PC12 обрабатывали NGF в течение 10 минут. После нанесения лиганда клетки немедленно лизировали и исследовали на TrkA, p-erk, p-akt, p-creb и актин в качестве контроля загрузки. В клетках HEK293, где было обнаружено небольшое количество эндогенного TrkA (с наблюдаемой слабой полосой), нет определяемого p-erk. Напротив, клетки PC12 показали высокий уровень экспрессии TrkA, он показал сильный p-erk. Для обеих клеток наблюдались аналогичные уровни p-creb и p-Akt. Клетки HEK293T, трансфицированные TrkA, демонстрировали сигнал p-erk, демонстрируя четкий контраст с нетрансфицированными клетками (рис.2в).

Рис. 2: Активация ERK с помощью TrkA.

a Схематическая диаграмма сигнального пути TrkA. b Вестерн-блот-анализ клеток PC12 и HEK293T за счет эндогенного TrkA в присутствии лиганда NGF для p-erk (фосфорилированный ERK по Thr202 и Tyr204), фосфорилированный akt, фосфорилированный CREB. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. c Вестерн-блоттинг клеток HEK293T в нетрансфицированных (Ø) и трансфицированных wt-TrkA (wt) зондировании на эндогенные TrkA, p-erk и общую ERK.β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. d Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих wt-TrkA, без (-) или с (+) NGF, и без (-) или с (+) УФ-светом, для pERK. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки.

Чтобы напрямую сравнить экспрессию TrkA, включенного в Uaa, в клетках HEK293T или PC12, мы котрансфицировали низкодифференцированные клетки PC12, используя тот же протокол, что и в клетках HEK293T, сохраняя TrkA-Y490amb и AzF-RS / Bst-tRNA _CUA. при тех же дозировках гена.Мы наблюдали, что выход в клетках PC12 значительно ниже (3% от WT-TrkA) (дополнительные рисунки 3 и 4), чем в клетках HEK293 (52,6% от WT-TrkA), предположительно из-за провокации в опосредованном липофектамином переходном процессе. трансфекция в линии нейрональных клеток. Далее мы охарактеризовали TrkA-Y490AzF индуцированную активацию ERK в клетках HEK293 (рис. 2). Экспрессию TrkA-Y490AzF в клетках HEK293T анализировали с помощью флуоресцентной визуализации и вестерн-блоттинга с использованием TrkA дикого типа в качестве контроля (дополнительный рис.5), что свидетельствует о всеобщем согласии. TrkA-Y490AzF был синтезирован только в тех клетках, которые коэкспрессируют Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr в присутствии экзогенно добавленного AzF (дополнительный рис. 5a – c, дорожка 4). В отсутствие AzF мы не наблюдали экспрессии TrkA с помощью вестерн-блоттинга (дополнительный рис. 5a – c, дорожка 3) и только незначительный сигнал EGFP (дополнительный рис. 5a, b, дорожка 3), подтверждая остановку трансляции. Измерение сигналов EGFP позволило нам количественно определить уровень экспрессии TrkA-Y490AzF, который неизменно составлял 52.6% уровней экспрессии TrkA дикого типа. Таким образом, мы использовали EGFP для визуализации экспрессии TrkA. Затем мы изучили активацию p-erk TrkA-Y490AzF. Интересно, что иммуноблот-анализ p-ERK показал, что мутант TrkA-Y490AzF не может инициировать p-erk (дополнительный рис. 5c), показывая, что замена азидогруппы в сайте Y490 ингибирует аутофосфорилирование. Таким образом, эти результаты показали, что HEK293T представляет собой удобную клеточную модель по сравнению с клетками PC12 для экспрессии TrkA сайт-специфически включенного с UAA и изучения передачи сигналов MAPK / ERK.В отличие от PC12 с высоким уровнем эндогенной экспрессии TrkA, HEK293T имеет низкий уровень эндогенного TrkA, он демонстрирует четкую активацию p-erk только тогда, когда экспрессируется экзогенный TrkA.

Включение AzF и ONB в сайты домена тирозинкиназы

Используя сайт Y490 в качестве ссылки, мы затем изучили включение AzF и ONB в TrkA в трех разных сайтах в домене тирозинкиназы, Y670, Y674 и Y675, соответственно (рис. 3а). Анализ флуоресцентной визуализации показал, что мутанты TrkA-AzF продуцировались до ~ 50% (в диапазоне от 33.От 4 до 52,6%) WT-TrkA (рис. 3b, дополнительный рисунок 6a и дополнительная таблица 1). Для сравнения, все мутанты TrkA-ONB имели немного более низкий уровень экспрессии, чем мутанты, содержащие AzF, в диапазоне от 29,1 до 35,8% от WT-TrkA (фиг. 3c, дополнительный рисунок 6b и дополнительная таблица 1). Рассчитывали средние урожаи мутантов TrkA (дополнительная таблица 1). Различия в выходах, измеренных с помощью флуоресцентной визуализации, в целом позволяют предположить, что мы наблюдаем эффективное подавление янтаря на различных участках-мишенях и, следовательно, эффективный синтез рецепторных белков, содержащих AzF и ONB.Кроме того, WT-TrkA и его мутантные варианты локализованы преимущественно на плазматической мембране (дополнительный рис. 7a, b).

Фиг. 3: Экспрессия мутантов TrkA, содержащих AzF или ONB в положениях 490, 670, 674 и 675 соответственно.

a Схематическая диаграмма полноразмерного TrkA с ECD, TM и внутриклеточными доменами TrkA. Лиганд NGF связывается с доменом ECD. Выделены четыре сайта фосфорилированного тирозина, подвергнутые мутации. b Эффективность включения мутантов TrkA AzF в отсутствие (серый цвет) или присутствие (темный цвет) AzF. c Выражение эффективности включения мутантов TrkA ONB в отсутствие (серый цвет) или присутствие (темный цвет) ONB. Эффективность включения описывалась как процентное отношение средней интенсивности флуоресценции в клетках, экспрессирующих рецепторы, включающие Uaa, к средней интенсивности флуоресценции в клетках, экспрессирующих рецепторы WT. n = 6 независимых экспериментов. Полосы ошибок показывают s.d.

УФ-инициированная сайт-зависимая передача сигналов ERK

Мы сначала протестировали УФ-стимулированную активацию p-erk с мутантом TrkA-Y490ONB.Под воздействием ультрафиолетового света ONB высвобождает заключенную в клетку группу, которая восстанавливает тирозин, а гидроксильная группа тирозина подвергается аутофосфорилированию (дополнительный рис. 8a и дополнительный рис. 11a, b). Чтобы оценить, вызывает ли фотоактивация ONB в сайте Y490 функциональные изменения в передаче сигналов ERK, мы применили УФ-свет к живым клеткам, экспрессирующим мутант, и с помощью иммуноблот-анализа p-erk после УФ-обработки. Клетки HEK трансфицировали TrkA-Y490ONB и подвергали непрерывной стимуляции УФ-светом (40 Вт) в течение 5 мин в присутствии лиганда NGF.После освещения клетки немедленно лизировали и исследовали на p-erk, общий erk и актин в качестве контроля нагрузки. В отсутствие УФ-света p-erk не был обнаружен в TrkA-Y490ONB из-за присутствия заключенной в клетку группы в ONB. УФ-освещение вызывало более четкое появление p-erk по сравнению с контрольным TrkA-Y490ONB (рис. 4a). Таким образом, наши результаты успешно продемонстрировали возможность активации p-erk посредством контроля света в единственном сайте фосфорилирования в TrkA, в котором Uaa ONB служит надежным переключателем света для контроля состояния фосфорилирования.

Фиг. 4: УФ-свет активирует сигнальный путь MAPK / ERK посредством сайт-специфически включенных AzF и ONB в TrkA.

a Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих мутанты ONB для фосфорилированной ERK (Thr202 и Tyr204) в присутствии лиганда NGF без (-) или с (+) УФ-светом. b Связывание NGF запускает димеризацию, аутофосфорилирование TrkA и инициирует внутриклеточный MAPK / ERK. В присутствии лиганда NGF ONB, включенный в сайты Y490, Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки).ONB, включенный в сайт Y670 (пустой кружок), не инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (ингибированная стрелка) c Вестерн-блот-анализ клеток HEK293T, экспрессирующих мутанты AzF для фосфорилированных ERK (Thr202 и Tyr204) без (-) или с (+) УФ-свет. УФ-фотолиз выполняли с помощью сшивающего агента УФ-сшивания 365 нм CL-1000L (Analytik Jena) при 40 Вт в течение 5 мин при 4 ° C. TrkA и β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. d Связывание NGF запускает димеризацию, аутофосфорилирование TrkA и инициирует внутриклеточный MAPK / ERK.В присутствии лиганда NGF, AzF, включенный в сайты Y670, Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки), предположительно из-за перекрестного связывания с предполагаемым интерактивным белком. AzF, включенный в сайт Y490 (пустой кружок), не инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (ингибированная стрелка).

Затем мы изучили, может ли включение ONB в любой из трех других тирозинов также инициировать передачу сигналов p-erk в TrkA-670, 674 и 675 (рис.4а и дополнительный рис. 11). В отсутствие УФ-обработки не было обнаружено p-erk ни ​​для одного из мутантов. После УФ-обработки два мутанта (TrkA-Y674ONB и TrkA-Y675ONB) показали сильную активацию p-erk, аналогичную той, что наблюдалась у мутанта TrkA-Y490ONB. Интересно, что мутант TrkA-Y670ONB не показал детектируемого p-erk с УФ-обработкой или без нее. Чтобы количественно оценить степень p-erk, интенсивность сигнала p-erk была измерена и нормализована к общему сигналу ERK среди всех мутантов в темноте или при УФ-освещении (дополнительный рис.9а и таблица 1). После стимуляции УФ-светом TrkA-Y490ONB инициировал 36,2% p-erk, TrkA-Y674ONB инициировал 44,6%, а TrkA-Y675ONB инициировал 32,0%, что значительно больше, чем отсутствие контроля УФ-излучения (16,3%, 7,3% и 4,4% соответственно. ) и нечувствительный к свету мутант TrkA-Y670ONB (отсутствие УФ: 3,1%, присутствие УФ: 3,6%). В качестве дополнительного контроля мы сделали обычные мутанты, а именно: TrkA-Y490F, Y670F, Y674F, Y675F, Y490D, Y670D, Y674D и Y675D. Считается, что фенилаланин (F) отменяет фосфорилирование, тогда как аспарагиновая кислота (D) может имитировать фосфорилированное состояние.Для всех мутантов F мы наблюдали значительное снижение p-erk по сравнению с рецепторами дикого типа (дополнительный рис. 10). Эти результаты продемонстрировали, что ONB в качестве переключателя света достаточно для усиления функции, чтобы индуцировать нижестоящую передачу сигналов ERK, обеспечиваемую включением в соответствующий регуляторный сайт фосфорилирования (рис. 4b). Среди трех тирозинов (Y670, Y674 и Y675), находящихся в петле активации киназного домена TrkA, Y674 и Y675 (но не Y670) могут использовать те же механизмы, что и Y490, для инициации передачи сигналов pERK путем аутофосфорилирования.

Таблица 1 Все сайты были обнаружены в тех же условиях, что и wt, и были повторены более трех раз.

Затем мы исследовали среди всех четырех участков индуцированный светом эффект AzF, который подвергается фотохимии, отличной от ONB. При УФ-возбуждении AzF обычно генерирует нитреновый радикал, который может восстанавливаться до амина или образует ковалентную связь с соседним атомом белка на расстоянии 3–4 Å ^30,32 (дополнительный рис. 8b). Поразительно, за исключением мутанта TrkA-490AzF, у которого не обнаруживается p-erk после стимуляции УФ-светом (отсутствие УФ: 11.4%, присутствие УФ: 7,8%), все три мутанта TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF продемонстрировали УФ-контролируемую активацию p-erk (34,1%, 29,7% и 37,4% соответственно) (рис. 4c, дополнительный рис. 9a и таблица 1), значительно больше, чем их контроли, обработанные без УФ (12,4%, 12,5% и 10,1% соответственно). Интересно, что мутанты Y674D и Y675D также продемонстрировали разные уровни снижения p-erk. Мутанты Y490D и Y670D сохраняли тот же уровень активации pERK по сравнению с WT.Взятые вместе, эти результаты показывают, что AzF может служить переключателем света для активации нижестоящей передачи сигналов ERK в рецепторах TrkA, предположительно через опосредованный AzF механизм фото-перекрестного связывания (рис. 4d), который отличается от фотохимии, которая генерировала фениламино. боковая цепь (дополнительный рис. 8а, б).

NGF-независимая передача сигналов ERK, контролируемая светом

Затем мы проверили, может ли УФ-световая стимуляция в TrkA напрямую активировать ERK без NGF (рис. 5a и дополнительный рис.11j – m). Все мутанты были экспрессированы и проанализированы в отсутствие и в присутствии NGF, и wt-TrkA служит контролем без детектируемого p-erk ни ​​без, ни с УФ-обработкой, подтверждая, что УФ-обработка сама по себе не вызывает значительных функциональных изменений. Интересно, что среди четырех мутантов ONB в отсутствие NGF как TrkA-Y674ONB, так и TrkA-Y675ONB проявляли УФ-индуцированную активацию p-erk по сравнению с контролем без УФ-обработки (80,4% и 39,0% соответственно) (рис. 5b, Дополнительный рис.9б и таблица 1). УФ-зависимая активация была аналогична контролю, обработанному в присутствии NGF. Напротив, TrkA-Y490ONB демонстрировал активацию p-erk, индуцированную УФ-светом, только в присутствии NGF, тогда как TrkA-Y670ONB не обнаруживал детектируемой активации p-erk во всех условиях (рис. 5b, c). Мы повторили тот же эксперимент с мутантами AzF, аналогичными TrkA-Y674ONB и TrkA-Y675ONB, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF имели независимую от NGF УФ-индуцированную активацию p-ERK (34,5% и 37,1% соответственно) (рис.5d, дополнительный рисунок 9b и таблица 1). В то время как TrkA-Y490AzF не обнаруживал детектируемой активации p-erk во всех условиях, а TrkA-Y670AzF демонстрировал только индуцированную УФ-светом активацию p-ERK в присутствии NGF. Все эти результаты подтверждают, что индуцированная светом активация посредством включения p-erk в AzF или ONB является высокоэффективной для имитации функции NGF в сайтах Y674 и Y675 (рис. 5d, e).

Рис. 5: УФ-свет активирует сигнальный путь MAPK / ERK независимо от лиганда NGF.

Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих wt-TrkA ( a ), мутанты ONB ( b ), включая TrkA-Y490ONB, TrkA-Y670ONB, TrkA-Y674ONB, TrkA-Y675ONB и мутанты AzF ( d ) в том числе TrkA-Y490AzF, TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF, TrkA-Y675AzF; без (-) или с (+) NGF, и без (-), или с (+) УФ-светом.TrkA и β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. В отсутствие лиганда NGF, ONB ( c ) или AzF ( e ), включенные в сайты Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициируют внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки). В случае AzF активация передачи сигналов предположительно происходит из-за фото-перекрестного связывания интерактивного белка в сигнальном комплексе MAPK / ERK. ONB ( c ) или AzF ( e ), включенные в сайты Y490 и Y670 (пустой кружок), не инициируют внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (ингибированная стрелка).

Чтобы подтвердить, сшивается ли мутант TrkA AzF с некоторыми белками при УФ-обработке, мы реализуем эксперимент по фото-перекрестному связыванию. Мы протестировали WT-TrkA, TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF в присутствии и отсутствии NGF, без УФ и с УФ (дополнительный рис. 12). Для всех условий мономер TrkA можно было обнаружить как характеристическую полосу 180 кДа. Под воздействием УФ-излучения мы наблюдали более высокие молекулярные полосы для мутантов TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF (~ 300 кДа) как в условиях + NGF, так и в условиях –NGF, но не в WT или TrkA-Y670AzF.

Экспрессия светочувствительного TrkA в нейрональной клеточной линии SH-SY5Y и контроль дифференцировки нейронов

Наконец, мы попытались протестировать светочувствительные мутанты TrkA в нейронах. Мы решили сначала сконцентрироваться на установлении контроля роста нейритов с помощью света в клетках SH-SY5Y, которые не имеют эндогенного TrkA, который скрывает функциональный эффект от мутантного TrkA, а также от световой активации. Для этого мы проверили, могут ли мутанты TrkA-ONB или AzF быть успешно экспрессированы.После временной трансфекции конструкций и добавления в культуральную среду Uaa (1 мМ), обработанного точно так же, как для клеток HEK293 и клеток PC12, мы наблюдали большое количество ярко-зеленых флуоресцентных клеток (дополнительный рис. 7b), которые были отсутствует в элементах управления, где не было добавлено Uaa. Это продемонстрировало правильное генетическое кодирование Uaa посредством спасения янтарного стоп-кодона ортогональной парой тРНК / aaRS. После этого успешного внедрения светочувствительных мутантов TrkA Uaa в клетки SH-SY5Y мы поставили задачу оценить рост нейритов при активации каждого тирозина УФ-светом и сравнили их дифференцировку в присутствии и в отсутствие NGF (рис.6). Клетки SH-SY5Y не проецируют нейриты при стимуляции NGF. Однако, когда они экспрессируются с помощью TrkA и обрабатываются NGF, клетки проецируют неврит (дополнительный рис. 7c), который представляет собой процесс, называемый дифференцировкой. Мы приступили к определению, могут ли мутанты TrkA-Uaa достичь аналогичного клеточного результата при стимуляции УФ-светом.

Рис. 6. Мутанты TrkA-ONB и AzF способствуют дифференцировке клеток SH-SY5Y в ответ на УФ-стимуляцию с NGF и без него.

a Типичные флуоресцентные изображения, изображающие клетки SH-SY5Y, экспрессирующие мутанты TrkA-ONB (два столбца слева) или AzF (два столбца справа), включенные в указанные сайты до (-UV) и после (+ UV) обработки со средой, содержащей 100 нг / мл NGF в течение 30 минут, и выдерживанием в темноте в течение 24 часов до визуализации. b Типичные флуоресцентные изображения, изображающие клетки SH-SY5Y, экспрессирующие мутанты TrkA-ONB (два столбца слева) или AzF (два столбца справа), включенные в указанные сайты до (-UV) и после (+ УФ) обработки средой. поставляется без NGF. c Коэффициенты дифференцировки были рассчитаны для различных мутантов, экспрессируемых в клетках SH-SY5Y в присутствии NGF с УФ-светом или без него. d Коэффициенты дифференцировки, рассчитанные для клеток SH-SY5Y в отсутствие NGF, экспрессирующего wt-TrkA (WT) или различных мутантов с УФ-светом или без него.Коэффициенты дифференциации рассчитывали, как описано в методе. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение шести биологических повторов ( n = 6) с> 200 клетками, подсчитанными на реплику. Масштабные линейки 10 мкм.

Клетки SH-SY5Y, экспрессирующие wt-TrkA, показали устойчивую дифференцировку при обработке 100 нг / мл NGF, что указывает на то, что экзогенный TrkA сохраняет чувствительность к лигандам и сигнальную активность (дополнительный рис. 7c). УФ-свет существенно не изменил дифференциацию. Для нетрансфицированных клеток дифференцировки не наблюдали.Чтобы определить функциональную роль Y490, Y670, Y674 и Y675 в дифференцировке, мы трансфицировали клетки SH-SY5Y мутантными конструкциями и освещали их в течение 30 минут, как описано ранее для экспериментов вестерн-блоттинга (рис.