Контроль за повреждениями и новая политика Airbnb после того, как вечеринка в честь Хэллоуина превратилась в место преступления в Калифорнии.Buzz60

Есть ли разница между арендой на Airbnb и B & B? Если вы сказали: «Конечно», возможно, вы опытный путешественник. Но если вы только что пожал плечами, присоединяйтесь к нам.

Границы между Airbnb — квартирой или комнатой, арендуемой через сайт совместного проживания, — и традиционным пансионом типа «постель и завтрак» (B&B) стираются. Даже у профессионалов не получается успевать. И это проблема.

«Airbnb использует название B&B», — говорит Хизер Тернер, директор по маркетингу Профессиональной ассоциации Innkeepers International, маркетинговой организации индустрии B&B.«Термины Airbnb и B&B взаимозаменяемы гостями — и журналистами».

Вкратце, вот разница между Airbnb и B & B. Airbnb — это слабо регулируемый сайт по совместному использованию жилья, который позволяет практически любому сдавать жилье в аренду. B & B — это небольшая гостиница, на которую распространяются государственные или местные законы о проживании. Думайте об этом как о небольшом отеле с несколькими дополнительными льготами и индивидуальными особенностями.

Почему люди сбиты с толку

Путешественников сбивает с толку не только название.Кроме того, на Airbnb можно найти отель типа «постель и завтрак», — говорит Джордан Локк, главный консультант отраслевой консалтинговой фирмы Rev Party Consulting. А поскольку Airbnb технически является онлайн-туристическим агентством, вы можете найти на этой платформе профессиональные отели типа «постель и завтрак». «Многие пансионаты и бутик-отели продаются через Airbnb, — говорит он.

Владельцы Airbnb в некоторых местах также действуют как владельцы B&B.

«Я заметила одну вещь: Airbnbs в Европе, особенно в Амстердаме, Ирландии и Шотландии, больше похожи на отели типа« постель и завтрак », — говорит Бетси Браун, менеджер некоммерческой организации в Роли, Северная Каролина.«Это стирает черту еще больше».

Другими словами, хосты Airbnb подражают более устоявшимся отелям типа «постель и завтрак» и, возможно, непреднамеренно создают еще больше путаницы.

Автозапуск

Показать миниатюры

Показать подписи

Так в чем разница?

Вторая «Б» в B&B (как в «завтраке») — самая большая отличительная черта.

«Разница между Airbnb и B & B начинается с бесплатного полноценного завтрака», — говорит Брайан Шилдс, владелец Manor On Golden Pond, небольшой гостиницы в Холдернессе, штат Нью-Гэмпшир.Гости отеля Manor начинают завтрак с «шведского стола» с фруктами, хлопьями, йогуртом и выпечкой, за которым следует горячее меню из восьми блюд. Он включен в стоимость проживания.

Типичный Airbnb будет иметь кухню, иногда заполненную кофе и чаем, но редко, если вообще когда-либо, хозяин готовит полный завтрак.

Но это еще не все:

«Уникальный» отель с индивидуальным обслуживанием. «Настоящий отель типа« постель и завтрак »обычно находится в независимом владении, и владелец живет на территории или поблизости, обеспечивает ежедневный завтрак и уборку, и это очень личный опыт», — объясняет Хана Певни, хозяин Airbnb и владелец гостиницы Waldo Emerson Inn в Кеннебанкпорте. Мэн.«Во многих случаях этот отель типа« постель и завтрак »является исторической собственностью или обладает уникальными качествами в здании или собственности». Дом, арендованный онлайн через Airbnb, тоже может быть особенным, но вам, возможно, придется готовить и убирать для себя. Вы также можете никогда не увидеть своего хозяина.

Гостиницы типа «постель и завтрак» или гостиницы типа «постель и завтрак», такие как Montgomery B&B в Старквилле, штат Миссисипи, как правило, находятся в независимой собственности, и владелец живет в собственности или поблизости. (Фото: Thomas Wells / AP)

Лицензирование и обучение. Настоящим B & B обычно управляет человек с формальным образованием в сфере гостеприимства. И у этого человека есть страховка — много страховки. Рене Хамфри, управляющая гостиницей Rainforest Inn в национальном лесу Эль-Юнке в Пуэрто-Рико, говорит, что ее собственность требует дорогостоящего страхования гражданской ответственности. «В рамках нашего лицензирования нас также проверяют как начальник пожарной охраны, так и отдел здравоохранения», — говорит она. Сезонная аренда, забронированная онлайн, имеет некоторую страховку (вы можете купить больше, чтобы покрыть возможную отмену), но ваши хозяева, вероятно, не имеют формального обучения гостеприимству.

Никаких «скрытых» комиссий. По крайней мере, так считает Пэм Уиллис, управляющая мини-гостиницей Gables Wine Country Inn в Петалуме, Калифорния. Комнаты в ее собственности также доступны на Airbnb. «Опубликованная ставка Airbnb кажется намного дешевле, но сборы увеличивают расходы», — объясняет она. «Хотя мы не берем плату за уборку, я видел, как гости платят до 70 долларов за ночь за обслуживание. Airbnb взимает с нас 3% от стоимости номера, так что для 250 долларов за номер это 7,50 доллара комиссии, но гость в конечном итоге платит намного больше.«

Один лучше другого? Нет, скажите гости.

« Я думаю, все сводится к стилю гостеприимства, — говорит Клейтон Дюрант, генеральный директор CAD Management, консалтинговой компании в сфере развлечений из Нью-Йорка ». Многие пансионаты предлагают многие из тех же удобств, например, односпальную кровать, ванную комнату и завтрак. У каждого Airbnb есть уникальная индивидуальность каждого дома и квартиры, в которых я останавливаюсь. Путешествие невозможно превзойти ».

Но сейчас, как никогда, важно знать, что есть разница.

Что лучше для вашего следующего отпуска: Airbnb или B & B?

Типичный Airbnb имеет кухню, иногда заполненную кофе, чаем или молоком, но, как правило, гости могут самостоятельно покупать продукты и готовить еду. (Фото: Vacasa.com)

Вот три ключевых вопроса, которые вам следует задать:

Вы занимаетесь своими руками или вам нравится индивидуальное обслуживание? Если вам нравится завтрак, ежедневная уборка и обслуживание на уровне консьержа, вам нужен отель типа «постель и завтрак».Если вам нравится готовить еду самостоятельно (и много уединения), выбирайте Airbnb.

Уютно или просторно? Дело в том, что большинство пансионатов предоставляют вам одну комнату — спальню — с общим общим пространством. Airbnb может дать вам весь дом. Если вы любите отдыхать во время путешествий, выбирайте Airbnb.

Вы пытаетесь сэкономить? Если вы остановились где-то более чем на неделю, Airbnb может быть гораздо более рентабельным — даже с учетом дополнительных сборов.

Airbnb, мошенничество при аренде жилья: Как распознать их и защитить себя

Переместитесь, Airbnb: Новая платформа для аренды жилья Golightly обслуживает только женщин

Автозапуск

Показать эскизы

Показать подписиNext4 Последний слайд

Прочтите или поделитесь этой историей: https: // www.usatoday.com/story/travel/hotels/2020/01/24/airbnb-vs-bb-whats-difference-and-which-is-better-for-you/4552257002/

Arn B Malmberg Auctioneer Barto, PA Auctioneers

Барто PA 19504

Отзывы

Меню и бронирование

Посмотреть наличие

Направления

Рекламные темы

Платеж

• Денежные средства
• Чек

границ | Фосфатаза PP2A взаимодействует с ArnA и ArnB для регулирования олигомерного состояния и стабильности комплекса ArnA / B

Введение

Фосфорилирование белков — одна из наиболее важных посттрансляционных модификаций в трех сферах жизни (Mok et al., 2010; Перейра и др., 2011; Reimann et al., 2013). Обратимый характер позволяет изменять свойства белка в различных клеточных процессах, включая рост, деление, метаболизм, подвижность и иммунитет (Wurzenberger and Gerlich, 2011; Hempel et al., 2012; Arthur and Ley, 2013), что может помочь клеткам быстро преобразовывать внешние и внутренние сигналы в постоянно меняющейся среде. Бактерии, археи и эукарии могут модифицировать свои белки, фосфорилируя их по остаткам серина, треонина и тирозина.Фосфорилирование гистидинов и аспартатов также обнаружено у бактерий, Euryarchaeota и некоторых Eukarya, где оно функционирует в двухкомпонентных системах передачи сигналов (TCS), но отсутствует у Crenarchaeota и Nanoarchaeota (Esser et al., 2016). Кроме того, фосфорилирование белков обнаруживается также для остатков цистеина, лизина и аргинина (Matthews, 1995; Khoury et al., 2011; Mijakovic et al., 2016).

Крупномасштабный фосфопротеомный анализ — широко используемый подход для понимания роли фосфорилирования белков в различных клеточных процессах. У Euryarchaeon Halobacterium salinarum полногеномный фосфопротеомный анализ выявил 69 Ser / Thr / Tyr-фосфопротеинов, что является прямым доказательством фосфорилирования Ser / Thr / Tyr, существующего у архей (Aivaliotis et al., 2009). Позже, в Crenarchaeon S. solfataricus P2, 540 уникальных Ser / Thr / Tyr-фосфопротеинов были также идентифицированы с помощью фосфопротеомного анализа, что свидетельствует о важной регуляторной роли фосфорилирования белка в S. solfataricus (Esser et al., 2012). Культивирование клеток S. solfataricus с различными источниками углерода (глюкоза и триптон) вызвало значительное изменение паттернов фосфо-белков, особенно белков, участвующих в центральном углеводном обмене, что предполагает роль фосфорилирования белков в регуляции потока углерода. У S. acidocaldarius фосфопротеомные исследования выявили 801 уникальный фосфопротеин, участвующий в большинстве клеточных процессов (Reimann et al., 2013). Примечательно, что отношение pTyr к посттрансляционной модификации pSer / pThr было намного выше у S.solfataricus и S. acidocaldarius , чем у Bacteria и Eukarya, что предполагает, что фосфорилирование тирозина играет гораздо более важную роль в Sulfolobales , возможно, чтобы дополнить отсутствие TCS.

Фосфорилирование белка у S. acidocaldarius относительно хорошо изучено с акцентом на его роль в регуляторной сети архаеллы. Архаелла S. acidocaldarius кодируется опероном fla , содержащим семь генов, который находится под контролем двух промоторов: основного индуцибельного промотора flaB и второго слабого конститутивного промотора flaX (Lassak et al., 2013). Как только клетки улавливают сигнал о голодании, активируется промотор flaB с последующей транскрипцией генов архаеллы. К настоящему времени идентифицировано несколько регуляторов, участвующих в регуляции архаеллы. Паралоги ArnR и ArnR1 являются мембраносвязанными позитивными регуляторами, чьи гены расположены выше и ниже оперона fla соответственно (Lassak et al. , 2013). Делеция arnR и arnR1 снижала экспрессию flaB и нарушала подвижность при плавании.Предыдущие эксперименты показали, что ArnR и ArnR1 регулируют промотор flaB , но не промотор flaX (Lassak et al., 2013; Bischof et al., 2019). AbfR1, регулятор биопленки архей, также является положительным регулятором экспрессии архаеллы, и его связывание с ДНК зависит от фосфорилирования (Orell et al., 2013; Li et al., 2017). Связанный с вилкой (FHA) домен ArnA и белок ArnB, содержащий домен фактора фон Виллебранда типа A (vWA), являются двумя негативными регуляторами экспрессии архаеллы, и их удаление привело к значительному увеличению экспрессии гена архаеллы (Reimann et al. al., 2012). Эти два белка сильно взаимодействовали друг с другом: in vitro и in vivo . Экспрессия arnA и arnB поддерживается постоянной в клетках, в то время как их взаимодействие последовательно снижается в клетках, лишенных питательных веществ (Hoffmann et al., 2019). В S. tokodaii , ST0829, гомолог ArnA, может специфически связываться с промоторной областью flaX (Duan and He, 2011), что предполагает участие ArnA в экспрессии архаеллы путем связывания с промоторами fla оперон.В S. tokodaii ePK (протеинкиназы типа Хэнкса) ST1565 физически взаимодействовали с белком, содержащим FHA-домен, ST0829, и фосфорилирование с помощью ST1565 могло негативно регулировать взаимодействие ST0829 с промоторной областью оперона, кодирующего белок архаеллы (Wang et al., 2010; Duan, He, 2011).

Одиннадцать ePK и aPK (неканонические протеинкиназы типа Хэнкса) кодируются в геноме S. acidocaldarius . Удаление saci_0965 , saci_1181 ( arnS ) и saci_1193 ( arnC ) уменьшало подвижность, в то время как делеция saci_1694 ( arnD ) вызывала гипермоторность клеток ( arnD )., 2017; Hoffmann et al., 2017). In vitro , ArnC фосфорилирует ArnA и ArnB, тогда как ArnD специфически фосфорилирует ArnB (Reimann et al. , 2012; Hoffmann et al., 2019). PTP (тирозинфосфатаза) и PP2A (серин / треонинфосфатаза) являются единственными двумя протеинфосфатазами в S. acidocaldarius (Reimann et al., 2013). Удаление saci_pp2a привело к значительному увеличению подвижности и изменению роста, формы и размера клеток. У мутанта с делецией PTP таких эффектов не наблюдалось.Кроме того, с помощью транскриптомного анализа было идентифицировано всего 155 дифференциально экспрессируемых генов в Δ saci_ptp и Δ saci_pp2a , включая гены, кодирующие компоненты архаеллы, компоненты дыхательной цепи и регуляторы транскрипции. Фосфопротеомный анализ позволил получить 551 специфический фосфопротеин в Δ saci_ptp , включая AbfR1, ArnB, ArnR1 и FlaJ, и 387 специфических фосфопротеинов в Δ saci_pp2a специфических фосфопротеинах, включая FlaJ.Состояние фосфорилирования Tyr 84 и Ser 87 AbfR1 регулирует взаимодействие с его собственным промотором и регулирующую функцию в образовании и подвижности биопленок (Li et al., 2017). Кроме того, недавнее исследование показало, что регулятор архаеллы ArnR и ArnR1 фосфорилируются с помощью ArnC in vitro , однако, участие фосфорилирования в регуляции их функций еще не было продемонстрировано (Bischof et al., 2019).

В этом исследовании мы намеревались выяснить роли PTP и PP2A в регуляторной сети архаеллы путем идентификации белков, которые взаимодействуют с PTP и PP2A.ArnA и ArnB были идентифицированы как важные белки, взаимодействующие с PP2A, и их взаимодействие и их зависимость от состояния фосфорилирования различных компонентов были проанализированы in vitro . Эта работа поможет нам лучше понять, как фосфорилирование белков участвует в регуляции экспрессии архаеллы у S. acidocaldarius .

Материалы и методы

Штаммы и условия роста

Sulfolobus acidocaldarius MW001 и производные мутанты, использованные в этом исследовании (дополнительная таблица S1), культивировали при 75 ° C и 120 об / мин в основной среде Брока (ph4. 0–3,5) с добавлением 0,1% (мас. / Об.) NZ-амина, 0,2% (мас. / Об.) Декстрина и 10 мкг / мл урацила (Brock et al., 1972; Wagner et al., 2012). Escherichia coli Штаммы , использованные в этом исследовании (дополнительная таблица S1), выращивали в бульоне Lysogeny (LB) или на чашках с агаром LB при 37 ° C и с ампициллином (50 мкг / мл), канамицином (25 мкг / мл) или хлорамфениколом ( 30 мкг / мл) добавляли при необходимости. E. coli Top 10 использовали для размножения плазмиды. E. coli ER1821 использовали для метилирования плазмид с целью трансформации в S.acidocaldarius . E. coli Rosetta (DE3) / pLysS использовали для сверхэкспрессии белков S. acidocaldarius .

Конструирование хромосомной HA-метки

Для конструирования плазмид для хромосомных C-концевых HA-меченных мутантов (дополнительная таблица S1) была проведена ПЦР перекрывающегося удлинения для получения перекрывающегося фрагмента, содержащего 500-900 п.н., расположенную выше исходного стоп-кодона, последовательность, кодирующую HA-tag с новый стоп-кодон и область на 400–500 п.н. ниже исходного стоп-кодона.Фрагменты перекрывающейся ПЦР клонировали в вектор pSVA407 для получения желаемых плазмид (дополнительная таблица S2). После секвенирования плазмиды трансформировали в E. coli ER1821 для метилирования. Метилированные плазмиды электропорировали в S. acidocaldarius MW001. Трансформанты отбирали на 1-ых селекционных пластинах (0,6% гельрита) без урацила и затем выращивали на 2-ых селекционных пластинах (0,6% -ный гельрит) с урацилом и 5-FOA (100 мкг / мл). Положительные мутанты подвергали скринингу с помощью ПЦР колоний с проверяющими праймерами (дополнительная таблица S2) и дополнительно подтверждали секвенированием.

Вестерн-блоттинг

Образцы белка разделяли на SDS-PAGE и наносили на мембрану PVDF (Roche). Мембрану инкубировали с первичным антителом против FlaB (Eurogentec) или HA-tag (Sigma) в течение ночи при 4 ° C. Впоследствии использовали вторичное козье антитело против кроличьей HRP (Invitrogen). Белки, меченные His и Strep, выявляли непосредственно с помощью антител против His-HRP (α-His) (Abcam) и против Strep-HRP (α-Strep) (IBA). Хемилюминесцентные сигналы визуализировали с помощью ECL Chemocam Imager (INTAS) с субстратом для блоттинга Clarity Western ECL (Bio-Rad).Вестерн-блоты по меньшей мере из трех биологических повторов количественно оценивали с помощью ImageJ (NIH).

Анализы подвижности

Анализы подвижности выполняли, как описано (Lassak et al., 2012). Штаммы Δ arnA и Δ arnR / R1 использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

Выделение РНК и qRT-PCR

получали, как описано (Lassak et al., 2012) из ​​10 мл культур, собранных при указанных условиях роста и временных точках с помощью метода TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Набор для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen) использовался для очистки гДНК от образцов общей РНК и синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Количественный ПЦР-анализ выполняли с помощью qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystems) и циклера для ПЦР в реальном времени Rotor-GeneQ (Qiagen). Значения Ct были нормализованы к таковым для контрольного гена secY . Для анализа использовали не менее трех биологических повторов и двух технических повторов.

Анализы коиммунопреципитации (co-IP) с анти-HA-магнитными шариками

Для каждого анализа совместного IP, 500 мл S.acidocaldarius , которую собирали после 0,5 ч роста в питательной среде голодания (базальная среда Брока (pH 3,0–3,5) с добавлением 10 мкг / мл урацила) при 75 ° C и 120 об / мин. Культуру охлаждали на льду, пока температура не приближалась к 37 ° C, и клетки собирали центрифугированием, затем ресуспендировали в буфере для лизиса (25 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP40, 5% глицерина) с добавлением ингибитора протеаз и ДНКазой I, разрушенного французской прессой (Thermo). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 48000 × g при 4 ° C в течение 20 минут и при 236000 × g и 4 ° C в течение 45 минут. После центрифугирования супернатант использовали для анализов совместного IP с набором Pierce HA-tag IP / co-IP (Pierce), как описано в инструкциях производителя. 20 мкл элюированной фракции использовали для SDS-PAGE. Белки во фракциях элюции co-IP анализировали окрашиванием серебром и масс-спектрометрией.

Анализ ЖХ-МС / МС

Масс-спектрометрический анализ в основном проводили, как описано у Schwenk et al.(2014). Вкратце, пептиды, полученные в результате гидролиза трипсином в геле, растворяли в 0,5% трифторуксусной кислоте и аликвоты загружали на предколонку C18 PepMap100 (размер частиц 5 мм; Dionex / Thermo Scientific, Германия) с 0,5% (об. / Об.) Уксусной кислотой, используя ВЭЖХ UltiMate 3000 на основе разделения (Dionex / Thermo Scientific, Германия). Связанные пептиды элюировали и разделяли водно-органическим градиентом от 0,5% (об. / Об.) Уксусной кислоты до 0,5% (об. / Об.) Уксусной кислоты в 80% (об. / Об.) Ацетонитриле (всего 1 час 20 мин) в Излучатель PicoTip (т.d. 75 мм; наконечник 8 мм; New Objective, США) вручную упаковали ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18; размер частиц 3 мм; Dr. Maisch HPLC, Германия) и распылили (2,3 кВ; температура капилляра 250 ° C) в тандем LTQ Orbitrap XL масс-спектрометр с описанными настройками.

Идентификация белка

Списки пиков были извлечены из спектров фрагментных ионов с помощью инструмента «msconvert.exe» (часть ProteoWizard, v3.0.6906, proteowizard.sourceforge.net; общий формат Mascot с параметрами фильтра «peakPicking true 1-» и «threshold count 500 most» -intense ») и значения предшественника m / z были сдвинуты на медиану m / z смещения всех пептидов, назначенных белкам при предварительном поиске в базе данных с 15 частями на миллион.Поиск исправленных списков пиков проводился с помощью Mascot 2.6 (Matrix Science, Великобритания) по базе данных протеома Sulfolobus acidocaldarius (UniProtKB / Swiss-Prot UP000001018, выпуск 2019-11, с добавлением записей для общих экзогенных загрязнений).

Ацетил (N-член белка), Карбамидометил (C), Этил (K), Формил (N-член), Формил (S), Формил (T), Gln → пиро-Glu (N-член Q), Glu → пиро-Glu (N-член E), окисление (M) и до одного пропущенного триптического расщепления допускались в качестве вариабельных модификаций.Допуск по массе пептида и фрагмента составлял ± 5 м.д. и ± 0,8 Да, соответственно. Отсечка ожидаемого значения для пептида была установлена ​​на 0,5. Белки, представляющие собой экзогенные загрязнения (например, кератины, трипсин, цепи IgG) или идентифицированные только одним специфическим пептидом, не рассматривались.

Количественное определение белка

Количественное определение белков без метки проводили, как описано в (Schmidt et al., 2017). Интенсивности пептидных сигналов (пиковые объемы, PV) при полном сканировании MS определяли и калибровали массу в автономном режиме с помощью MaxQuant v1.6.3.3. Время элюирования пептида PV в оцененных наборах данных было попарно выровнено с использованием регрессии LOESS (контрольные времена были динамически рассчитаны из среднего времени элюирования пептида по всем выровненным наборам данных). Затем PV были отнесены к пептидам на основе их m / z и времени элюирования, полученного либо непосредственно из идентификации на основе MS / MS, либо косвенно с использованием программного обеспечения собственной разработки (допуски соответствия ± 2 ppm и ± 1 мин) . Молекулярное содержание белков оценивали с использованием показателя распространенности _норма , определяемого как сумма всех назначенных и специфичных для изоформ белка PV, деленная на количество аминокислот, специфичных для изоформ протеина, доступных для MS (Bildl et al., 2012). Совместную очистку белков оценивали путем расчета соотношений белков и из их 6 или 50% (любое число больше) наиболее согласованных ПВ пептидов [метод TopCorr, (Bildl et al., 2012)] в соответствующей мишени по сравнению с контрольными АР.

Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантных белков в

20 мл ночной культуры инокулировали в 2 л среды LB с соответствующими антибиотиками. Клетки выращивали при 37 ° C до достижения OD ₆₀₀ , равного 0.5–0,6 и индуцированный изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) (конечная концентрация 500 мкМ). Затем рост продолжали в течение ночи при 16 ° C. Клетки собирали центрифугированием, суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис, pH 8, 150 мМ NaCl) с добавлением ингибитора протеаз и ДНКазы I и разрушали с помощью французского пресса (Thermo). Клеточный дебрис и тельца включения удаляли центрифугированием при 48000 g при 4 ° C в течение 20 минут. Стадия теплового шока выполнялась с надосадочной жидкостью при 70 ° C в течение 20 минут с последующим ультрацентрифугированием при 236000 g в течение 45 минут.Супернатант использовали для аффинной очистки. Меченные His белки (ArnA, ArnB, PP2A и ArnC) очищали с использованием гранул Ni-NTA. Очистку проводили в буфере для лизиса с использованием градиента имидазола 10–200 мМ на гравитационной колонке. Белки, меченные Strep II (ArnA и ArnB), очищали с использованием стрептавидиновых гранул. Градиент концентрации 2,5 мМ дестиобиотина в буфере для лизиса использовали для элюирования белков, меченных Strep II, из колонки. Фракции элюирования после аффинной очистки наносили на колонку исключения размера Superdex 200 (16/600) (SEC; GE Healthcare Life Sciences), которую предварительно уравновешивали буфером для лизиса.

Восстановление протеинового комплекса

Для восстановления комплекса ArnA / B in vitro смешивали равные количества очищенных ArnA и ArnB и инкубировали на льду в течение 1 часа. После инкубации смесь наносили на колонку для исключения размера Superdex 200 (16/600) для отделения восстановленного комплекса от индивидуальных белков. Фракции, полученные после размерной обменной хроматографии, анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим. Фракции, содержащие восстановленный комплекс, объединяли для дальнейшего использования.

Анализы фосфорилирования in vitro проводили, как описано (Reimann et al., 2012) при 55 ° C в присутствии и в отсутствие киназы ArnC (100 нМ) и [γ- ³² P] ATP (32 нМ ) в буфере для лизиса, содержащем 1 мМ MnCl ₂ и 2 мкМ белка (ArnA, ArnB или комплекс ArnA / B).

Для приготовления ³² Р-меченых образцов фосфорилированного белка было выполнено анализов фосфорилирования in vitro с 100 нМ киназы ArnC и 32 нМ [γ- ³² P] АТФ в буфере для лизиса, содержащем 1 мМ MnCl ₂ и 2 мкМ белка (ArnA, ArnB или комплекс ArnA / B).После 40 мин инкубации при 55 ° C добавляли 100-кратный избыток немеченого АТФ и PP2A (200 нМ) и отбирали образцы в разные моменты времени.

Анализ межбелкового взаимодействия in vitro проводили с очищенными белками, меченными His и Strep, в буфере, содержащем буфер для лизиса. 500 мкл каждого белка (0,3 мг / мл) смешивали и инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин. Смесь наносили на наконечник PureSpeed ​​объемом 1000 мкл с 20 мкл смолы IMAC (Mettler Toledo) в соответствии с инструкциями производителя.Для стадии элюирования использовали 50 мкл лизирующего буфера, содержащего 500 мМ имидазола. Все собранные фракции анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против α-His и α-Strep II. Для получения фосфорилированных белков, меченных Strep, соответствующий белок фосфорилировали путем добавления 8 мкг меченного His ArnC и инкубации при 55 ° C в течение 30 мин. Меченный His ArnC удаляли путем пропускания образца через наконечник PureSpeed ​​Tip, а проточная фракция представляла собой образец фосфорилированного белка, меченного Strep, который использовали для анализа взаимодействия с белками, меченными His.

Аналитическая эксклюзионная хроматография

Аналитическая эксклюзионная хроматография по размеру выполнялась на исключительной колонке с увеличением размера Superdex 200 (16/600) или Superdex 200 (10/300) в буфере для лизиса при 1,0 и 0,7 мл / мин. Для анализа влияния фосфорилирования и дефосфорилирования на стабильность комплекса ArnA / B 300 мкг очищенного комплекса ArnA / B инкубировали либо с 8 мкг ArnC, либо с 40 мкг PP2A. Объемы инъекции составляли 2000 и 500 мкл соответственно, и были использованы следующие стандарты белка (Bio-Rad): тиреоглобулин (бычий) 670 000 Да, гамма-глобулин (бычий) 158 000 Да, овальбумин (курица) 44 000 Да, миоглобин (лошадь). ) 17000 Да, витамин B12 1350 Да.

Массовая фотометрия

Пробы белка разводили из 10-кратного исходного раствора до конечных концентраций 20–100 нМ в 50 мМ Трис-буфере при pH 8,0 и 150 мМ NaCl. Измерения проводили на Refeyn OneMP с использованием очищенных покровных стекол для высокоточных микроскопов (24 × 60 мм, Marienfeld) и силиконовых прокладок (многоразовые прокладки CultureWell ^TM , артикул: 103250). Прокладки были заполнены 18 мкл буфера для регулировки фокуса с использованием максимального уровня резкости от 6 до 7. Затем были добавлены 2 мкл раствора белка и кратко перемешаны перед началом получения 6000–12000 изображений.Чтобы преобразовать полученные значения контраста в молярные массы, перед экспериментом была построена стандартная кривая в том же буфере, как описано выше, с использованием известных масс из стандарта белка Novex ^TM NativeMARK ^TM (Invitrogen). Все растворы и буферы перед использованием подвергали стерильной фильтрации. Гистограммы были обработаны и дополнены аналитическим программным обеспечением Refeyn Discover ^MP (v2.2.0).

Результаты

PTP и PP2A — единственные две протеинфосфатазы в S.acidocaldarius . Делеционные мутанты этих фосфатаз обнаруживают более высокие уровни фосфорилирования некоторых белков в регуляторной сети архаеллы, а делеция PP2A приводит к повышенной экспрессии архаеллы и увеличению подвижности (Reimann et al., 2013). Однако подробности того, как они регулируют этот процесс, не ясны. Систематический анализ белок-белковых взаимодействий был эффективным подходом к разгадке сложной сети взаимодействия (Breitkreutz et al., 2010). В этом исследовании мы намеревались идентифицировать белки в регуляторной сети архаеллы, которые взаимодействуют с фосфатазами посредством co-IP.

Экспрессия PTP и PP2A с меткой НА в

Последовательности, кодирующие C-концевые HA-метки, были интегрированы в геном для облегчения совместного IP PTP и PP2A. Чтобы исключить функциональные дефекты или какие-либо полярные эффекты PTP и PP2A у S. acidocaldarius из-за вставки HA-метки, тесты подвижности на полутвердых гельритовых пластинах и рост в богатых питательными веществами условиях обоих мутантов сравнивали с исходными. MW001 штамм. Ни по плавательному поведению, ни по общему росту различий не наблюдалось (Рисунки 1A, B).Эти результаты показывают, что вставка С-концевых НА-меток не влияла на функцию ни PTP, ни PP2A in vivo .

Рисунок 1. Экспрессия HA-tagged PP2A и PTP. (A) Кривые роста клеток S. acidocaldarius , выращенных в богатой питательными веществами среде при 75 ° C, были получены для родительского штамма MW001 (черный сплошной кружок) и красок, содержащих HA-меченный PP2A (черный открытый квадрат) и PTP. (черный открытый кружок). OD _{, 600,} каждого штамма измеряли в указанные моменты времени.Показано среднее значение трех независимых экспериментов. (B) Для анализов подвижности экспоненциально растущие культур S. acidocaldarius с OD ₆₀₀ 0,4 были нанесены на полутвердые гельритовые планшеты с 0,005% (мас. / Об.) NZ-амина и инкубированы при 75 ° C для 5 дней до сканирования пластин. Анализы подвижности повторяли с тремя биологическими и шестью техническими повторами. Показан репрезентативный эксперимент. (C) Экспрессия HA-tagged PTP и (D) PP2A в S.acidocaldarius . Мутанты PTPHA и PP2AHA выращивали на богатой питательными веществами и голодной среде в течение 4 часов. Образцы собирали в разные моменты времени (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 4,0 ч) и анализировали вестерн-блоттингом с α-HA. Показаны репрезентативные вестерн-блоты. Количественная оценка трех независимых экспериментов показана под блотами.

Ранее, через 4 часа после переноса в среду голодания, архаеллы можно было обнаружить с помощью электронной микроскопии, а плавающие клетки можно было наблюдать с помощью термомикроскопа (Haurat et al., 2017). Чтобы определить наилучший момент времени для проведения ко-IP, уровни экспрессии PTP, PP2A и архаеллина FlaB, который кодирует протеин филаментов архаеллы, были определены в различные моменты времени в течение 4 часов роста в богатых питательными веществами и голодных условиях. средний (дополнительный рисунок S1). Экспрессия PTP увеличивалась в течение 4 часов роста в богатой питательными веществами среде, тогда как она значительно снижалась по сравнению с 1,0 часа роста в питательной среде голодания (Рисунок 1C). Экспрессия PP2A была выше, чем экспрессия PTP, и не претерпела значительных изменений во время роста в обеих средах, за исключением небольшого снижения после 4.0 ч роста в голодной среде (рис. 1D).

Экспрессию FlaB определяли как на уровне транскрипта мРНК, так и на уровне белка. Через 0,5 часа было обнаружено начальное повышение уровней транскрипта flaB , за которым последовало повышение уровней белка FlaB через 1–1,5 часа (дополнительный рисунок S2). Поскольку ожидалось, что взаимодействия PTP и PP2A с компонентами регуляторной сети архаеллы могут происходить особенно во время ранних фаз экспрессии архаеллы, образцы для коиммунопреципитации были собраны 0.Через 5 ч после перевода на голодную среду.

Исследования локализации PTP и PP2A в клетках, выращенных в голодной среде в течение 0,5 часа, показали, что PTP и PP2A можно было идентифицировать в основном в цитоплазматических фракциях, а не в изолированных мембранах (дополнительный рисунок S3). Таким образом, совместные IP-процедуры проводили без добавления детергентов для солюбилизации возможных компонентов мембраны.

Идентификация белков, связанных с PTP и PP2A

Для идентификации белков, связанных с PTP и PP2A, S.acidocaldarius собирали после 0,5 ч роста в среде голодания. Цитоплазматические фракции клеточных образцов были приготовлены и использованы для анализов совместного IP с магнитными шариками против НА. Родительский штамм MW001 использовали в качестве стандарта. Для повышения специфичности со-IP проводили без добавления сшивающих агентов. Белки во фракциях элюирования разделяли на SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием серебром (дополнительная фигура S4).

Полосы PTP и PP2A можно отчетливо наблюдать в образцах PTPHA и PP2AHA соответственно.Как и ожидалось, интенсивность PP2A была выше, чем у PTP. Между профилями белков MW001 и PTPHA не наблюдалось значительных видимых различий, но при сравнении PP2AHA с MW001 наблюдались некоторые дополнительные полосы.

Образцы co-IP были проанализированы с помощью масс-спектрометрии, и молекулярное содержание идентифицированных белков было построено в зависимости от их обогащения по сравнению с co-IPs, выполненными в MW001 (рис. 2). Для PTPHA не было идентифицировано высокообогащенных белков взаимодействия, но для PP2AHA консервативный предполагаемый связывающий белок ATP / GTP (Saci_1281), универсальный стрессовый белок (Saci_0887) и регуляторы архаеллы ArnA и ArnB были идентифицированы как высокообогащенные после сочетания PP2A-HA. -IPs.Гомологи предполагаемого АТФ / GTP-связывающего белка Saci_1281 и универсального стрессового белка Saci_0887 высококонсервативны и участвуют во многих различных процессах (см. Обсуждение). Негативные регуляторы экспрессии архаеллы ArnA и ArnB сильно взаимодействуют друг с другом как in vitro, , так и in vivo , и их делеция приводит к значительному увеличению экспрессии гена архаеллы (Reimann et al., 2012). Их экспрессия в клетках остается постоянной, однако их взаимодействие последовательно прекращается в клетках, лишенных питательных веществ (Hoffmann et al., 2019). С-концевой домен ArnB мог фосфорилироваться с помощью ArnC in vitro (Hoffmann et al., 2017) и был обнаружен фосфорилированный in vivo , что предполагает, что фосфорилирование / дефосфорилирование этого домена может влиять на его взаимодействие с ArnA (Hoffmann и др., 2019). Действительно, здесь ArnA и ArnB идентифицированы как очень распространенные белки взаимодействия PP2A. Поэтому взаимодействие между ArnA, ArnB и фосфатазой PP2A изучено более подробно.

Рисунок 2. Количественный масс-спектрометрический анализ аффинных очисток (AP) PP2A и PTP из S. acidocaldarius . Идентифицированные и количественно определенные белки отображаются в виде кружков на логарифмических графиках их молекулярной распространенности (рассчитанной как концентрация _{, норма} значения спецификации, см. Методы) в зависимости от их обогащения (отношения) в целевом АР для (A) HA-PP2A и (B) HA-PTP относительно контрольного AP из клеток дикого типа. Серые кружки указывают на неспецифически связывающиеся белки, тогда как первичные белки-мишени АР и специфически очищенные интеракторы окрашены в красный и светло-оранжевый цвета соответственно.

ArnA и ArnB образуют стабильный комплекс

Чтобы проверить, можно ли восстановить комплекс ArnA / B из очищенных белков, ArnA с N-концом, меченный Strep, и ArnB с C-концом, меченный His, были сверхэкспрессированы и очищены от E. coli . После эксклюзионной хроматографии Strep-ArnA и ArnB-His элюировались в виде симметричных пиков при объемах, соответствующих молекулярным массам ~ 60 и 40 кДа, соответственно (рис. 3A). Когда Strep-ArnA и ArnB-His были смешаны, они элюировали с более высокой молекулярной массой ~ 80 кДа по сравнению с отдельными белками, что указывает на то, что ArnA и ArnB образуют стабильный комплекс in vitro .Особенно очевиден сдвиг в характере элюирования ArnB. Чтобы подтвердить это, используя другой метод, 300 мкг ArnA-His, ArnB-His и фракции, содержащие комплекс ArnA-His / ArnB-His, снова загружали на эксклюзионную хроматографию и фракции элюирования, содержащие ArnA, ArnB и Комплекс ArnA / B анализировали с помощью масс-фотометрии (рисунки 3B – D), в результате чего были получены молекулярные массы 63,7 ± 2,3, 47,0 ± 1,7 и 66,0 ± 1,0 кДа, соответственно. Объединение результатов гель-фильтрации и масс-фотометрических экспериментов с молекулярными массами Strep-ArnA и ArnB-His, равными 26.8 кДа и 43,6, можно сделать вывод, что ArnA образует димер и что наиболее вероятно, что ArnA и ArnB образуют комплекс со стехиметрией 1: 1.

Рис. 3. Восстановление комплекса ArnA / B in vitro . (A) Очищенный Strep-ArnA (пунктирная линия), ArnB-His (серая линия) или 300 мкг ArnA-His и ArnB-Strep (черная линия) инкубировали на льду в течение 1 часа, загружали на SD200. 16 Столбец исключения размера / 600. Фракции элюции разделяли на SDS-PAGE и анализировали окрашиванием Кумасси.Показан SDS-PAGE белковых фракций, элюируемых из колонки для исключения размера для эксперимента, в котором были смешаны равные количества ArnA-His и ArnB-Strep. Масс-фотометрия комплекса (B), , 100 нМ ArnA, (C), , 20 нМ ArnB и (D), , 50 нМ ArnA / B.

Фосфорилирование белка стимулирует дальнейшее комплексное образование ArnA и ArnB

Для изучения влияния фосфорилирования белка на взаимодействие ArnA / B было проведено анализов взаимодействия белка in vitro между ArnA-His и ArnB-Strep с нефосфорилированным и фосфорилированным ArnB-Strep.Чтобы получить фосфорилированный ArnB, ArnB инкубировали с ArnC и АТФ в присутствии Mn ²⁺ . Образцы загружали на смолу Ni-NTA, промывали и элюировали имидазолом, и образцы наносили на гель (рис. 4A). ArnB-Strep оставался на колонке в присутствии ArnA-His, но не удерживался в отсутствие ArnA-His, что снова демонстрирует взаимодействие между ArnA и ArnB in vitro. Примечательно, что значительно больше ArnB-Strep удерживалось на колонке при фосфорилировании ArnB-Strep, что показывает, что фосфорилирование белка увеличивает взаимодействие ArnA-ArnB.Чтобы проанализировать возможное влияние фосфорилирования белка на олигомерное состояние или стехиометрию комплекса ArnA / B, фосфорилированный комплекс ArnA / B анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (рис. 4B) и масс-фотометрии (рис. 4C). Фосфорилирование комплекса ArnA / B приводило к образованию комплексов, которые элюировались при объемах элюирования, соответствующих молекулярной массе 60-540 кДа. Примечательно, что фосфорилирование ArnA также привело к повышению молекулярной массы ArnB. Масс-фотометрия была проведена с использованием фосфорилированного комплекса ArnA / B и показала зависимое от концентрации образование дополнительного комплекса ArnA / B с массой 136.0 ± 8.9, что, скорее всего, представляет собой тетрамерный комплекс (ArnA / B) ₂ . Это зависело от Mn ²⁺ -зависимого фосфорилирования комплекса с помощью ArnC, поскольку не наблюдалось образования олигомерных комплексов (ArnA / B) ₂ или выше в присутствии только Mn ²⁺ или ArnC в присутствие хелатора Mn ²⁺ EDTA (см. дополнительный рисунок S5).

Фигура 4. Анализ взаимодействия in vitro ArnA и ArnB. (A) ArnB-Strep (верхняя панель), ArnA-His и не-фос-ArnB-Strep (левые полосы средней и нижней панели) или ArnA-His и фос-ArnB-Strep (правые полосы средней и нижней панели) ) инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин и наносили на Ni-аффинную смолу, промывали и элюировали имидазолом. Фракции анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против α-His (средняя панель) и α-Strep (верхняя и нижняя панель). СТ: исходные материалы; FT: проточный; W1: 1-я промывочная фракция; WL: фракция последней промывки; E: фракция элюирования. (B) Комплекс ArnA / B, собранный на Фигуре 3A, инкубировали с Mn ²⁺ и АТФ в присутствии (черная линия) и в отсутствие (серая линия) ArnC при 55 ° C в течение 30 минут и загружали на Столбец исключения размера Superdex 200 увеличить (10/300). На верхней панели изображена картина элюирования, наблюдаемая при 280 нм. Фракции элюции разделяли на SDS-PAGE и анализировали окрашиванием Кумасси. SDS-PAGE белковых фракций вокруг наблюдаемых пиков показаны на нижней панели. (C) Масс-фотометрия комплекса 50 нМ ArnA / B.

Образование комплекса ArnA / B стимулирует фосфорилирование ArnB с помощью ArnC и дефосфорилирование ArnB с помощью PP2A

Чтобы проверить, влияет ли образование комплекса ArnA / B на кинетику фосфорилирования ArnA и ArnB, была исследована кинетика фосфорилирования Strep-ArnA, ArnB-His, смеси Strep-ArnA и ArnB-His и изолированного комплекса ArnA / B с помощью ArnC. определяется (рис. 5А). Как было показано ранее, ArnB фосфорилировался с большей скоростью, чем ArnA, но гораздо более высокие скорости фосфорилирования и конечные уровни фосфорилирования наблюдались для ArnB в смеси Strep-ArnA / ArnB-His и даже более явно для совместно очищенного комплекса ArnA / B. .Это предполагает, что образование комплекса ArnA / B приводит к конформационным изменениям в ArnB, что делает сайты фосфорилирования в ArnB более доступными для ArnC. Чтобы выяснить, может ли PP2A дефосфорилировать ArnB, были проведены анализы дефосфорилирования с PP2A (рис. 5B). ArnB-His, смесь Strep-ArnA и ArnB-His и изолированный комплекс ArnA / B были сначала фосфорилированы ArnC с использованием ³² P-γ-ATP, после чего избыток немеченого АТФ (для предотвращения дальнейшего фосфорилирования с помощью ³² P) и PP2A (Рисунок 5B).Как и ожидалось, очищенный PP2A может дефосфорилировать как свободный ArnB, так и ArnB в комплексе с ArnA, но не сам ArnA. Сигнал фосфорилирования ArnB был количественно определен, и кинетика дефосфорилирования была нанесена на график (рис. 5C). Это показало, что дефосфорилирование ArnB в комплексе с ArnA происходит с более высокой скоростью, чем дефосфорилирование свободного ArnB. Таким образом, как фосфорилирование с помощью ArnC, так и дефосфорилирование ArnB с помощью PP2A стимулируются в комплексе ArnA / B (Фигуры 5A, C).

Рисунок 5. Скорости фосфорилирования ArnB с помощью ArnC и дефосфорилирования с помощью PP2A увеличиваются в комплексе ArnA / B. (A) 2 мкМ ArnA, ArnB, смешанная смесь ArnA / B или изолированный комплекс ArnA / B инкубировали при 55 ° C в присутствии 100 мкМ АТФ с добавлением [γ- ³² P] АТФ и 100 нМ ArnC. в течение разного времени, разделенных на SDS-PAGE, и уровни фосфорилирования были определены с помощью фосфо-визуализации. (B) 2 мкМ ArnB, смешанный ArnA / B или изолированный комплекс ArnA / B сначала инкубировали при 55 ° C в присутствии 100 мкМ АТФ с добавлением [γ- ³² P] АТФ и 100 нМ ArnC.Через 40 минут добавляли 100-кратный избыток немеченого АТФ и 200 нМ PP2A и отбирали образцы в разные моменты времени, разделяли на SDS-PAGE и гели анализировали с помощью фосфо-визуализации (верхняя панель). (C) Количественная оценка сигналов фос-ArnB из трех независимых анализов дефосфорилирования. Черные круги, ArnB; пустые квадраты, смесь ArnA / B; черные закрашенные треугольники, комплекс ArnA / B.

PP2A сильнее всего взаимодействует с фосфорилированным ArnB, и дефосфорилирование ArnB приводит к комплексной диссоциации

Чтобы определить, влияет ли образование комплекса ArnA / B и фосфорилирование на взаимодействие с PP2A, in vitro анализы взаимодействия белков между PP2A-His и Strep-ArnA и ArnB-Strep и комплексом Strep-ArnA / ArnB-Strep с фосфорилированием и без по ArnC.ArnB-Strep (фиг. 4) и Strep-ArnA (фиг. 6A) не удерживались на колонке в отсутствие PP2A-His. Небольшие количества Strep-ArnA (фиг. 6B) и ArnB-Strep (фиг. 6C) оставались на колонке, когда они инкубировались с PP2A-His, и не наблюдали значительных различий, когда Strep-ArnA или ArnB-Strep фосфорилировались с помощью ArnC. . Скорее всего, здесь не наблюдалось никаких эффектов из-за относительно низкой скорости фосфорилирования отдельных белков ArnA и ArnB (см. Рисунок 5). Гораздо больше ArnB-Strep удерживалось на колонке, когда PP2A-His инкубировали с комплексом Strep-ArnA / ArnB-Strep, и количество ArnB-Strep, удерживаемого на колонке, увеличивалось после фосфорилирования комплекса ArnA / B с помощью ArnC ( Рисунок 6D).Это показывает, что PP2A взаимодействует с более высоким сродством с фосфорилированным ArnB в присутствии ArnA. Примечательно, что это взаимодействие, по-видимому, приводит к дестабилизации комплекса ArnA / B, поскольку совместно очищенный ArnA почти не обнаружен.

Рисунок 6. PP2A сильнее взаимодействует с фосфорилированным комплексом ArnA / ArnB, и дефосфорилирование комплекса приводит к диссоциации комплекса. (A) Strep-ArnA, (B) PP2A-his и не-фос / фос Strep-ArnA, (C) PP2A-his и non-phos / фос ArnB-Strep, и (D) PP2A-his и комплекс не-фос / фос-Strep-ArnA / ArnB-Strep инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин и наносили на Ni-аффинную смолу, промывали и элюировали имидазолом.Фракции анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против α-His (верхняя панель) и α-Strep (верхняя и нижняя панель). СТ — исходные материалы; FT, проточный; W1, 1-я промывочная фракция; WL, фракция последней промывки; E, фракция элюирования.

На заключительном этапе влияние взаимодействия с PP2A и дефосфорилирования на комплекс ArnA / B анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (Фигуры 7A, B). Инкубация комплекса ArnA / B и фосфорилированного олигомерного комплекса ArnA / B с PP2A в присутствии Mn ²⁺ приводила к диссоциации комплексов на ArnA и ArnB, демонстрируя, что взаимодействие с PP2A и дефосфорилирование меняет направление (ArnA / B ) _n комплексообразование.Таким образом, фосфорилирование с помощью ArnC приводит к образованию олигомерных комплексов (ArnA / B) ₂ и выше, а взаимодействие и дефосфорилирование с помощью PP2A приводит к диссоциации этих комплексов. Поскольку PP2A представляет собой Mn ²⁺ -зависимую фосфатазу, добавление хелатора Mn ²⁺ EDTA позволило проверить, достаточно ли взаимодействия с PP2A для диссоциации комплекса ArnA / B в отсутствие активности фосфатазы (рис. 7). Действительно, комплекс ArnA / B диссоциировал после инкубации с EDTA и PP2A (фиг. 8), что указывает на то, что взаимодействия PP2A с комплексом ArnA / B достаточно для диссоциации комплекса ArnA / B.Однако кажется вероятным, что фосфатазная активность PP2A будет вносить дополнительный вклад в диссоциацию фосфорилированного олигомерного комплекса ArnA / B. Важно отметить, что добавление EDTA к комплексу ArnA / B не влияло на олигомерное состояние комплекса ArnA / B (фиг. 8), демонстрируя, что сайт связывания металла MIDAS ArnB не участвует в образовании комплекса.

Рис. 7. Взаимодействие с PP2A и дефосфорилирование диссоциирует комплекс ArnA / B. (A) Образцы инкубировали с Mn ²⁺ при 55 ° C и загружали в колонку для исключения увеличения размера Superdex 200 (10/300).ArnB (синяя линия) или комплекс ArnA / B (серая линия) инкубировали в течение 30 мин. Комплекс ArnA / B инкубировали в течение 30 мин в присутствии (оранжевая линия) или в отсутствие (черная линия) ArnC и АТФ с последующей инкубацией с PP2A в течение 30 мин. Комплекс ArnA / B, инкубированный в течение 30 мин с ArnC и АТФ, отмечен зеленой линией. Показаны картины элюирования, наблюдаемые при 280 нм. (B) Элюированные фракции разделяли на SDS-PAGE и анализировали окрашиванием Кумасси. Показаны SDS-PAGE белковых фракций вокруг наблюдаемых пиков.

Рисунок 8. Связывания PP2A с комплексом ArnA / B достаточно для диссоциации комплекса. (A) PP2A (оранжевая линия) или комплекс ArnA / B (серая линия) инкубировали в течение 30 минут с EDTA при 55 ° C. Комплекс ArnA / B инкубировали в течение 30 мин в присутствии ЭДТА (черная линия) при 55 ° C с последующей инкубацией с PP2A в течение 30 мин при 55 ° C. Образцы загружали в колонку исключения увеличения размера Superdex 200 (10/300). Показаны картины элюирования, наблюдаемые при 280 нм. (B) Элюированные фракции разделяли на SDS-PAGE и анализировали окрашиванием Кумасси. Показаны SDS-PAGE белковых фракций вокруг наблюдаемых пиков.

Обсуждение

Здесь мы намеревались изучить роль фосфатаз PTP и PP2A S. acidocaldarius , уделяя особое внимание их роли в синтезе архаеллы в ответ на недостаток питательных веществ. Слияние PTP и PP2A с C-концевыми HA-метками не влияло ни на скорость роста, ни на плавательную подвижность in vivo и позволяло определять уровни PTP и PP2A во время нормального роста и во время роста на среде голодания.Экспрессия PP2A существенно не изменилась во время роста на богатой среде или в первые четыре часа после переноса на питательную среду, в то время как уровни PTP увеличивались во время роста в питательной среде, в то время как они снижались во время роста в питательной среде голодания. Таким образом, в условиях голодания изменяются только уровни PTP, но не PP2A. Примечательно, что только делеция гена, кодирующего PP2A, но не гена, кодирующего PTP, повлияла на подвижность, демонстрируя более важную роль PP2A, чем PTP в регуляции подвижности.Наше наблюдение, что уровни PP2A не менялись во время роста, указывает на то, что влияние уровней фосфорилирования белков на подвижность регулируется путем изменения экспрессии / активности протеинкиназ, таких как Saci_0965, ArnC, ArnD и ArnS (Haurat et al., 2017 ; Hoffmann et al., 2017), но, возможно, и другие факторы могут влиять на активность фосфатазы PP2A.

Поскольку ожидалось, что взаимодействия фосфатаз с компонентами регуляторной сети архаеллы или с белками, которые изменяют активность фосфатаз, происходят во время более ранних фаз экспрессии архаеллы, были собраны образцы для коиммунопреципитации (co-IP) 0 .Через 5 ч после перевода на голодную среду. В этот момент была обнаружена первая экспрессия FlaB, и экспрессируются как PP2A, так и PTP. Поскольку многие Ser / Thr-фосфорилированные или Tyr-фосфорилированные белки были ранее идентифицированы (Reimann et al., 2013), и только две фосфатазы присутствуют в S. acidocaldarius , ожидалось много партнеров по взаимодействию, и для идентификации наиболее значимых партнеров необходимо совместное использование -IP эксперименты проводили без сшивания и в строгих условиях. Для PTP-HA в этих условиях не были идентифицированы высокообогащенные белки взаимодействия, но для PP2A-HA, Saci_0887, универсальный стрессовый белок (USP), Saci_1281, консервативный предполагаемый связывающий белок ATP / GTP, и регуляторы архаеллы ArnA и ArnB были сильно обогащены после совместных IP.Высокая специфичность этих взаимодействий предполагает, что наряду с возможными фосфорилированными субстратами для PP2A эти белки могут быть взаимодействующими партнерами, которые модулируют активность PP2A.

Saci_1281, ГТФаза GPN-петли была самым обогащенным белком, идентифицированным при раскрытии PP2A. Малые GTPases широко распространены во всех трех сферах жизни и функционируют как молекулярные переключатели, циклически переключающиеся между GTP-связанными и GDP-связанными состояниями, которые модулируют нижестоящие эффекторные белки, которые участвуют во множестве клеточных процессов (Wittinghofer and Vetter, 2011).ГТФазы петли GPN содержат консервативный мотив Gly-Pro-Asn (названный петлей GPN) и были идентифицированы только у архей и эукарий. У Eukarya часто обнаруживаются три гомолога (GPN1, GPN2 и GPN3), которые участвуют в ядерной локализации и биогенезе RNAPII (Wittinghofer, Vetter, 2011; Alonso et al., 2013; Niesser et al., 2016; Guerrero- Серрано и др., 2017). У архей обычно кодируется один гомолог, но физиологическая функция еще не известна. Было обнаружено, что GPN-петля GTPase PAB0955 из Pyrococcus abyssi взаимодействует с ДНК-топоизомеразой VI (субъединица B), ДНК-примазой DnaG и RF-C (малая субъединица) и способна автофосфорилировать по остаткам Ser и Thr (Gras et al. al., 2007). В исследовании фосфопротеома S. acidocaldarius было обнаружено, что Saci_1281 фосфорилируется по Tyr-59, но не было обнаружено фосфорилирования Ser или Thr (Reimann et al., 2013).

Вторым наиболее обогащенным белком, идентифицированным в раскрывающемся списке PP2A, был универсальный стрессовый белок Saci_0887. Члены суперсемейства универсальных стрессовых белков (USP) были идентифицированы во всех трех царствах жизни (Vollmer and Bark, 2018). Многие виды бактерий имеют несколько паралогов генов, кодирующих эти белки, и делеция генов часто не дает четкого фенотипа.Как правило, белки USP экспрессируются в различных стрессовых условиях окружающей среды, что предполагает важную роль этих белков в общих стрессовых ответах (Kvint et al., 2003; Vollmer and Bark, 2018). Было обнаружено, что у бактерий белки USP участвуют в росте и выживании клеток в условиях стресса, подвижности, формировании биопленок и вирулентности патогена по отношению к хозяину (Kvint et al., 2003; Nachin et al., 2005; O’Connor and McClean , 2017; Воллмер, Барк, 2018). У растений эти белки имели решающее значение для устойчивости к абиотическим стрессам, включая засуху, осмотический стресс и аноксию (Vollmer and Bark, 2018).Хотя физиологическая функция и структурное разнообразие USP были тщательно изучены, механизмы, с помощью которых функционируют USP, все еще в значительной степени неизвестны. Примечательно, что было показано, что несколько белков USP фосфорилируются (Freestone et al., 1997), но в исследовании фосфопротеома S. acidocaldarius , Saci_0887 не был идентифицирован как фосфорилированный белок (Reimann et al., 2013). Насколько нам известно, это первый раз, когда выявляется сильное взаимодействие между USP и фосфатазой.

Универсальный стрессовый белок Saci_0887 и GTPase Saci_1281 являются вероятными кандидатами для модуляции активности фосфатазы PP2A, которая может регулировать различные клеточные процессы, и эта модуляция и регуляция должны стать предметом дальнейших исследований. Здесь мы сосредоточились на биохимической характеристике взаимодействия между PP2A и ArnA и ArnB, двумя членами регуляторной сети архаеллы.

ArnA и ArnB взаимодействуют и присутствуют на постоянных уровнях даже при ограничении питательных веществ (Hoffmann et al., 2019). Примечательно, что сильное взаимодействие между ArnA и ArnB, которое наблюдалось во время роста на богатой среде, последовательно уменьшалось после переноса на среду голодания (Hoffmann et al., 2019). Поскольку фосфорилированные формы ArnA и ArnB были обнаружены in vivo и in vitro (Reimann et al., 2012; Hoffmann et al., 2019), было высказано предположение, что взаимодействие между ArnA и ArnB зависит от их состояния фосфорилирования. . Здесь мы показали, что стехиометрический комплекс ArnA / B 1: 1 может быть восстановлен из очищенных рекомбинантных компонентов.Примечательно, что сильная петля обратной связи наблюдалась там, где повышенное фосфорилирование с помощью ArnC приводило к большему образованию комплекса ArnA / B, что сильно стимулировало фосфорилирование ArnB с помощью ArnC, приводя к высокофосфорилированному ArnB в олигомерном комплексе ArnA / B. PP2A затем сильно взаимодействовал с этим фосфорилированным ArnB, что приводило к дефосфорилированию ArnB и диссоциации комплекса.

Образование и диссоциация комплекса ArnA / B основано на тонком равновесии комплексообразования / фосфорилирования киназами и взаимодействия с фосфатазой PP2A / дефосфорилирования и диссоциации комплекса.Анализ этой регуляторной сети дополнительно осложняется прямым, косвенным и, возможно, перекрывающимся действием киназ и фосфатазы на другие фосфорилированные белки в регуляторной сети архаеллы, такие как регуляторы ArnR, ArnR1 и AbfR1, и их связывание с ДНК. Эти взаимодействия должны стать предметом будущих исследований.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направить соответствующему автору.

Авторские взносы

XY, CD и SV-A разработали эксперименты, проанализировали данные и написали рукопись. XY внесла свой вклад в большинство экспериментов и фигур. MV и L-OE внесли свой вклад в массовый фотометрический анализ и рисунки. CD участвовал в in vitro анализах фосфорилирования с использованием радиоактивно меченного АТФ. WB и US внесли свой вклад в анализ МС белков и цифры. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Работа поддержана Китайским стипендиальным советом (Ph.D. стипендия XY), пожизненным грантом Az-96727 Фонда Volkswagen и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) — Project-ID 403222702 — SFB 1381 и в рамках стратегии совершенства Германии CIBSS — EXC-2189 — Project ID 3

984 и AL1206 / 4-3. Мы ценим помощь Георга Хохберга с его масс-фотометром.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.01849/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Айвалиотис М., Мацек Б., Гнад Ф., Райхельт П., Манн М. и Остерхельт Д. (2009). Фосфорилирование белков Ser / Thr / Tyr в архее Halobacterium salinarum — представитель третьей области жизни. PLoS One 4: e4777. DOI: 10.1371 / journal.pone.0004777

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Алонсо, Б., Беро, К., Мегеллати, С., Чен, С. В., Пеллекер, Дж. Л., Арменгауд, Дж. И др. (2013). Паралоги GTPases эукариотической петли GPN используют димерную сборку, напоминающую археальный GPN. Cell Cycle 12, 463–472. DOI: 10.4161 / cc.23367

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бильдл, В., Хаупт, А., Müller, C.S., Biniossek, M. L., Thumfart, J. O., Hüber, B., et al. (2012). Расширение динамического диапазона безметки масс-спектрометрического количественного определения аффинных очисток. Мол. Клетка. Протеомика 11: M111.007955.

Google Scholar

Bischof, L.F., Haurat, M.F., and Albers, S.-V. (2019). Два мембраносвязанных фактора транскрипции регулируют экспрессию различных поверхностных структур пилей типа IV у Sulfolobus acidocaldarius . PeerJ 7: e6459.DOI: 10.7717 / peerj.6459

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брайткройц, А., Чой, Х., Шаром, Дж. Р., Буше, Л., Недува, В., Ларсен, Б. и др. (2010). Глобальная сеть взаимодействия протеинкиназ и фосфатаз в дрожжах. Наука 328, 1043–1047.

Google Scholar

Брок, Т. Д., Брок, К. М., Белли, Р. Т., и Вайс, Р. Л. (1972). Sulfolobus : новый род сероокисляющих бактерий, живущих при низком pH и высокой температуре. Arch. Микробиол. 84, 54–68. DOI: 10.1007 / bf00408082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуань, X., и He, Z.-G. (2011). Характеристика специфического взаимодействия между белком, содержащим домен FHA архей, и промотором жгутикового кластера генов и его регуляция путем фосфорилирования. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 407, 242–247. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2011.03.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эссер, Д., Hoffmann, L., Pham, T. K., Qiu, W., Wright, P. C., Br, C., et al. (2016). Фосфорилирование белков и его роль в передаче сигнала архей. FEMS Microbiol. Ред. 40, 625–647. DOI: 10.1093 / femsre / fuw020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эссер Д., Фам Т. К., Рейманн Дж., Альберс С. В., Зиберс Б. и Райт П. К. (2012). Изменение источника углерода вызывает драматические эффекты в фосфопротеоме архея Sulfolobus solfataricus . J. Proteome Res. 11, 4823–4833. DOI: 10.1021 / pr300190k

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фристоун, П., Нистро, Т., Триней, М., и Норрис, В. (1997). Универсальный стрессовый белок UspA Escherichia coli фосфорилируется в ответ на застой. J. Mol. Биол. 274, 318–324. DOI: 10.1006 / jmbi.1997.1397

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гра, С., Шомон, В., Фернандес, Б., Карпентье, П., Шарье-Савурнин, Ф., Шмитт, С. и др. (2007). Структурные сведения о новом семействе гомодимерных самоактивируемых ГТФаз. EMBO Rep. 8, 569–575. DOI: 10.1038 / sj.embor.7400958

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Герреро-Серрано, Г., Кастанедо, Л., Кристобаль-Мондрагон, Г. Р., Монтальво-Арредондо, Дж., Риего-Руиз, Л., ДеЛуна, А. и др. (2017). Карбоксиконцевой хвост Npa3 / ScGpn1 необязателен для жизнеспособности клеток и нацеливания на ядро ​​РНК-полимеразы II, но критичен для стабильности и функции микротрубочек. Biochim. Биофиз. Acta Mol. Cell Res. 1864, 451–462. DOI: 10.1016 / j.bbamcr.2016.12.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Haurat, M. F., Figueiredo, A. S., Hoffmann, L., Li, L., Herr, K., Wilson, A. J., et al. (2017). ArnS, киназа, участвующая в экспрессии архаеллы, вызванной голоданием. Мол. Microbiol. 103, 181–194. DOI: 10.1111 / mmi.13550

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хемпель, А.M., Cantlay, S., Molle, V., Wang, S.-B., Naldrett, M.J., Parker, J.L. и др. (2012). Ser / Thr протеинкиназа AfsK регулирует полярный рост и ветвление гиф у нитчатых бактерий Streptomyces . Proc. Natl. Акад. Sci. США 109, E2371 – E2379.

Google Scholar

Hoffmann, L., Anders, K., Bischof, L.F., Ye, X., Reimann, J., Khadouma, S., et al. (2019). Структура и взаимодействия модуля репрессии подвижности архей ArnA-ArnB, который модулирует экспрессию гена архей у Sulfolobus acidocaldarius . J. Biol. Chem. 294, 7460–7471. DOI: 10.1074 / jbc.ra119.007709

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hoffmann, L., Schummer, A., Reimann, J., Haurat, M. F., Wilson, A.J., Beeby, M., et al. (2017). Расширение регуляторной сети архаеллы — эукариотические протеинкиназы ArnC и ArnD влияют на подвижность Sulfolobus acidocaldarius . Microbiologyopen 6: e00414. DOI: 10.1002 / mbo3.414

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хури, Г.А., Балибан, Р. К., Флудас, К. А. (2011). Статистика посттрансляционных модификаций в масштабе протеома: частотный анализ и курирование базы данных swiss-prot. Sci. Реп. 1:90.

Google Scholar

Kvint, K., Nachin, L., Diez, A., and Nystro, T. (2003). Бактериальный универсальный стресс-белок: функция и регуляция. Curr. Opin. Microbiol. 6, 140–145. DOI: 10.1016 / S1369-5274 (03) 00025-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лассак, К., Нейнер, Т., Гош, А., Клингл, А., Вирт, Р., и Альберс, С. (2012). Молекулярный анализ жгутика кренархей. Мол. Microbiol. 83, 110–124. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2011.07916.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лассак К., Петерс Э., Врубель С. и Альберс С. В. (2013). Однокомпонентная система ArnR: мембраносвязанный активатор архаеллы кренархей. Мол. Microbiol. 88, 125–139. DOI: 10.1111 / mmi.12173

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Л., Банерджи, А., Бишоф, Л.Ф., Маклад, Х.Р., Хоффманн, Л., Хенче, А. и др. (2017). Фосфорилирование крыльев является основным функциональным детерминантом биопленки типа Lrs14 и регулятора подвижности AbfR1 у Sulfolobus acidocaldarius . Мол. Microbiol. 105, 777–793. DOI: 10.1111 / mmi.13735

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мэтьюз, Х. Р. (1995). Протеинкиназы и фосфатазы, которые действуют на остатки гистидина, лизина или аргинина в эукариотических белках: возможный регулятор каскада митоген-активируемых протеинкиназ. Pharmacol. Ther. 67, 323–350. DOI: 10.1016 / 0163-7258 (95) 00020-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миякович И., Гранжасс К. и Тургай К. (2016). Изучение разнообразия модификаций белков: специальные системы фосфорилирования бактерий. FEMS Microbiol. Ред. 40, 398–417. DOI: 10.1093 / femsre / fuw003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мок, Дж., Ким, П. М., Лам, Х. Ю. К., Пиччирилло, С., Чжоу, X., Jeschke, G.R., и др. (2010). Расшифровка специфичности протеинкиназы посредством крупномасштабного анализа мотивов сайтов фосфорилирования дрожжей. Sci. Сигнал. 3: ra12. DOI: 10.1126 / scisignal.2000482

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Начин, Л., Наннмарк, У., и Нистро, Т. (2005). Дифференциальные роли универсальных стрессовых белков Escherichia coli в устойчивости к окислительному стрессу, адгезии и подвижности. J. Bacteriol. 187, 6265–6272. DOI: 10.1128 / JB.187.18.6265

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ниссер, Дж., Вагнер, Ф. Р., Кострева, Д., Мюльбахер, В., и Крамер, П. (2016). Структура GPN-петли GTPase Npa3 и значение для сборки РНК-полимеразы II. Мол. Клетка. Биол. 36, 820–831. DOI: 10.1128 / mcb.01009-15

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орелл А., Петерс Э., Вассен В., Яхлевски С., Шаллес С., Зиберс Б. и др.(2013). Регуляторы транскрипции Lrs14 влияют на формирование биопленок и подвижность клеток кренархей. ISME J. 7: 1886. DOI: 10.1038 / ismej.2013.68

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перейра С.Ф., Госс Л. и Дворкин Дж. (2011). Эукариотоподобные серин / треонинкиназы и фосфатазы у бактерий. Microbiol. Мол. Биол. Ред. 75, 192–212. DOI: 10.1128 / mmbr.00042-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейманн, Дж., Esser, D., Orell, A., Amman, F., Pham, T. K., Noirel, J., et al. (2013). Передача сигнала архей: влияние делеций протеинфосфатазы на размер, подвижность и энергетический метаболизм клеток у Sulfolobus acidocaldarius . Мол. Клетка. Протеомика 12, 3908–3923. DOI: 10.1074 / mcp.M113.027375

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейманн, Дж., Лассак, К., Хадума, С., Эттема, Т. Дж. Г., Янг, Н., Дриссен, А. Дж. М. и др. (2012). Регуляция экспрессии архаелл с помощью FHA и белков, содержащих домен фон Виллебранда, ArnA и ArnB у Sulfolobus acidocaldarius . Мол. Microbiol. 86, 24–36. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2012.08186.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schmidt, N., Kollewe, A., Constantin, C.E., Henrich, S., Ritzau-Jost, A., Bildl, W., et al. (2017). Нейропластин и базигин являются важными вспомогательными субъединицами плазматической мембраны Ca ²⁺ -АТФаз и ключевыми регуляторами клиренса Ca ²⁺ . Нейрон 96, 827–838.e9 DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.09.038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Швенк, Дж., Baehrens, D., Haupt, A., Bildl, W., Boudkkazi, S., Roeper, J., et al. (2014). Региональное разнообразие и динамика развития протеома AMPA-рецептора в головном мозге млекопитающих. Нейрон 84, 41–54. DOI: 10.1016 / j.neuron.2014.08.044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фоллмер, А.С., и Барк, С.Дж. (2018). Двадцать пять лет исследования универсального стресс-белка: функция, структура и применение , 1-е изд. Амстердам: Elsevier Inc.DOI: 10.1016 / bs.aambs.2017.10.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wagner, M., Van Wolferen, M., Wagner, A., Lassak, K., Meyer, B.H., Reimann, J., et al. (2012). Универсальный генетический ящик для кренархеотов Sulfolobus acidocaldarius . Перед. Microbiol. 3: 214. DOI: 10.3389 / fmicb.2012.00214

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Б., Ян С., Чжан Л. и Хэ З.-Г.(2010). Серин / треониновая протеинкиназа, подобная архейным эукариотам, взаимодействует с белком, содержащим связанный домен вилки, и фосфорилирует его. J. Bacteriol. 192, 1956–1964. DOI: 10.1128 / jb.01471-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Виттинггофер А., Веттер И. Р. (2011). Структурно-функциональные отношения домена G, канонический мотив переключения. Annu. Rev. Biochem. 80, 943–971. DOI: 10.1146 / annurev-biochem-062708-134043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

B-17 FLYING FORTRESS ИНДИКАТОР РАДИОКОМПАСА AN / ARN-7

Указатель радиокомпаса AN / ARN-7 был большим из двух показаний индикатора автоматической системы радиокомпаса AN / ARN-7, который позволял летательному аппарату осуществлять навигацию через наведение на радиосигнал, обычно передаваемый с аэродрома базирования самолета, и был предшественником современных систем радиопеленгации (RDF), действующих сегодня во всем мире.

Система радиокомпаса обычно состояла из приемника, установленного в носовом бомбовом отсеке; пульты управления, установленные на постах второго пилота и радиста; реле для переключения управления с одного блока на другой; рамочную антенну автоматического пеленгования, установленную на фюзеляже над бомбоотсеком; выдвижная штыревая антенна в кормовой части верхней передней башни, указатели поворота на приборной панели пилота и на столе радиста. Система RDF работала в диапазоне частот от 200 до 1750 кГц в трех диапазонах.

Тюнер / приемник работал, выбирая заданную частоту в прозрачном окне и затем вращая настроечный рычаг, который вращал рамочную антенну с помощью гибкого вала. Когда радиостанция оказалась в фокусе, большая стрелка на индикаторе радиокомпаса повернулась и указала на направление сигнала по компасу. Пилот в основном поддерживал этот компас на всем пути до базы.

Этот индикатор радиокомпаса AN / ARN-7, по-видимому, работает с большим диском, свободно вращающимся через верхнюю ручку, но требует проверки и обслуживания.Есть очень информативное видео на YouTube от коллекционера радио из США, демонстрирующее, как это устройство работает со всеми его компонентами: https://www.youtube.com/watch?v=5ujIPiCkjaM

Этот прибор B-17 Flying Fortress поставляется в комплекте с подробной масштабной моделью, подставкой из дерева манго и табличкой, а также печатным информационным бюллетенем с фотографией прибора в кабине самолета.

Вернуться на ГЛАВНУЮ СТРАНИЦУ B-17

Это Sparks Worthington, указатель компаса B-17 ARN-7 корпуса связи армии США находится в прекрасном состоянии для своего возраста и имеет табличку с заводским и серийным номером на задней стороне, а также дату производства 1943 года на замке.

Ваш B-17 Flying Fortress ARN-7 Compass Indicator, Original Recovery Curios Warbird Collectable включает:

• Оригинальный инструмент Warbird
• Высокодетализированная пластиковая модель самолета ручной сборки с аэрографией в масштабе 1/72. *
• Изготовленный вручную и красиво отделанный 100-летний стенд из дерева манго в Крайнем Севере Квинсленда
• Подробный, двусторонний, напечатанный и ламинированный информационный бюллетень по приборам с подробным описанием самолетов и приборов
• Съемный магнитный кронштейн для дисплея

* Обновление до более крупной и более детализированной модели в масштабе 1/48 также доступно в пластиковой версии ручной сборки и с аэрографией за дополнительные 80 долларов США (нажмите на вариант масштаба 1/48)

Пластиковые модели, изготовленные вручную в масштабе 1/72 и 1/48, и модели с аэрографом, доступны с вариантами «колеса и закрылки вверх или вниз» и «купол открыт или закрыт» с возможностью выбора из двух маркировок Squadron и камуфляжа.

После размещения заказа вы получите электронное письмо с просьбой указать предпочтительную конфигурацию.

Ваш комплект Recovery Curios Original Instrument Collectable надежно упакован, и доставка обычно занимает от 3 до 4 недель.

Вы летали, управляли или обслуживали B-17 Flying Fortress, или у вас был друг, коллега или член семьи, которые это делали? Ознакомьтесь с нашим ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННЫМ ОРИГИНАЛЬНЫМ ИНСТРУМЕНТОМ СБОРНЫЙ ВАРИАНТ здесь.

ARN-B — Профиль акций Arconic

Страница профиля дает вам общую информацию о символе, будь то о компании или контракте.Гистограмма показывает разные данные на странице профиля в зависимости от типа актива символа.

Акции

Страница профиля акции содержит общую информацию об акциях, такую ​​как символ тикера, торгуемые на бирже, контактный адрес / телефон компании, генеральный директор / президент и описание компании. Он также включает ссылки на отрасль, сектор и индекс, к которому принадлежит акция: код SIC или Стандартной отраслевой классификации, отраслевые группы и индексы основных рынков, включая три индекса Доу-Джонса и их композит, Nasdaq 100 и S&P 500, 100 и 400.Что касается акций, всю фундаментальную информацию предоставляет Zachs Investment Research.

Ключевая статистика

• Рыночная капитализация, $ K : капитализация или рыночная стоимость акции — это просто рыночная стоимость всех находящихся в обращении акций. Он рассчитывается путем умножения рыночной цены на количество акций в обращении. Например, публичная компания с 10 миллионами акций, которые торгуются по 10 долларов каждая, будет иметь рыночную капитализацию в 100 миллионов долларов.
• Акции в обращении, K : Обыкновенные акции, находящиеся в обращении, по данным компании на 10-Q или 10-K.
• Годовой объем продаж, долл. США: Годовой объем продаж, выраженный в миллионах долларов.
• Годовая чистая прибыль, долл. США: Годовая чистая прибыль, выраженная в миллионах долларов.
• Продажи за последний квартал, долл. США: Продажи за последний квартал, выраженные в миллионах долларов.
• Чистая прибыль за последний квартал, долл. США: Чистая прибыль за последний квартал, выраженная в миллионах долларов.
• 60-месячная бета : Коэффициент, который измеряет волатильность доходности акции относительно рынка (S&P 500). Он основан на 60-месячной исторической регрессии доходности акций на доходность S&P 500.
• % институциональных акционеров : процент владения, принадлежащий крупным финансовым учреждениям или организациям.
• Float, K : выпущенные компанией акции, доступные для торговли (акции в обращении — акции с ограниченным доступом).
• % Float : процент обычных акций, доступных для торговли.

Таблица роста

Доходность за 1-3 и 5 лет скорректирована с учетом дроблений.

Информация на акцию

• Последняя прибыль : сумма последней выплаченной акционерам прибыли на акцию (EPS) и дата выплаты. Самые последние показатели прибыли основаны на доходах не по GAAP от продолжающейся деятельности.
• Дата следующего отчета : Дата следующего отчетного отчета.
• Прибыль на акцию : Промежуточная прибыль на акцию за 12 месяцев от общей суммы операций представляет собой чистую прибыль после всех расходов, деленную на средневзвешенное количество обыкновенных акций в обращении. Например, если компания имеет 10 миллионов долларов чистой прибыли и 10 миллионов выпущенных акций, то ее прибыль на акцию составляет 1 доллар.
• Рост прибыли на акцию по сравнению с предыдущим кварталом : рост прибыли на акцию по сравнению с предыдущим кварталом.
• Рост на акцию по сравнению с предыдущим годом : рост прибыли на акцию по сравнению с предыдущим годом.
• Годовая ставка дивидендов : Указанный годовой дивиденд, рассчитанный на основе последнего дивиденда. Для ETF годовые дивиденды выплачиваются за последние двенадцать месяцев. Ставка дивидендов — это часть прибыли компании, выплачиваемая акционерам, выраженная в долларах, которые получает каждая акция (дивиденды на акцию).
• Годовая дивидендная доходность : Указанная годовая дивидендная доходность, рассчитанная на основе последних дивидендов. Доходность — это сумма дивидендов, выплачиваемых на акцию, деленная на цену закрытия.
• Самый последний дивиденд: Самый последний выплаченный дивиденд и самая последняя дата выплаты дивидендов.
• Дата следующей выплаты дивидендов: Акционеры, зарегистрированные на эту дату, имеют право на получение любых выплаченных дивидендов.
• Дата выплаты дивидендов : Дата, на которую предполагается выплата следующих дивидендов.
• Коэффициент выплаты дивидендов : Последняя выплата дивидендов — это процент от чистой прибыли, выплачиваемой акционерам в виде дивидендов.
• Последнее дробление : Зарегистрированное дробление акций и дата, когда произошло дробление.

ETFs

Страница профиля ETF также показывает общую информацию о фонде, но также добавляет информацию, например ссылку на семейство фондов. Базовый индекс. Дата начала, дата первой сделки и кредитное плечо.

Таблица инвестиционной информации

Доходность с начала года, 1-3 и 5 лет скорректирована с учетом дивидендов и долей.

Фьючерсы

Профиль для товарного контракта содержит спецификации контракта .Технические характеристики включают:

• Символ — корневой символ товара.
• Наименование — наименование товара
• Биржа — биржа, на которой торгуется товар.
• Месяцы — Конкретный месяц, в котором может происходить поставка в соответствии с условиями фьючерсного контракта. Товарные биржи обычно обозначают месяцы, используя одну букву:
  • Январь = F
  • Февраль = G
  • Март = H
  • Апрель = J
  • Май = K
  • Июнь = M
  • Июль = N
  • Август = Q
  • сентябрь = U
  • октябрь = V
  • ноябрь = X
  • декабрь = Z
• Размер — (иногда называемый торговой единицей) относится к единице измерения, в которой торгуется контракт.Общие сокращения, которые вы увидите, включают:
  • bu = бушель
  • lbs = фунты
  • cwt = сотня веса
  • bbl = баррель
  • gal = галлон
  • мм btu = миллион британских тепловых единиц
  • bd = дощатый фут
  • oz = унция
  • M = миллион
  • ct = центы
  • pt = point
• Размер тика — наименьшее допустимое приращение движения цены для контракта.
• Дневной лимит — максимальная прибыль или убыток, который товар может достичь за данную торговую сессию.
• Часы торговли — дни и часы, в которые торгуется товар.
• Последний торговый день — день, в который прекращаются торги для этого товара в течение каждого Торгового месяца.
• Стоимость одной фьючерсной единицы — мера изменения цены фьючерса на один базисный пункт.
• Стоимость одной единицы опциона — мера изменения цены опциона на один базисный пункт.
• Описание Ежегодника CRB — для сырьевых товаров будет опубликована статья Ежегодника CRB за предыдущий год.Информация включает описание товара, цены, спрос, предложение и торговую статистику.

Коэффициенты

Коэффициенты для акций отображают следующую информацию:

• Цена / прибыль ttm — Цена закрытия, деленная на прибыль на акцию на основе последних двенадцати месяцев (TTM) прибыли.
• Цена / прогноз прибыли — Оценка прогнозируемой цены на прибыль на акцию.
• Цена / прибыль к росту — Коэффициент роста цены / прибыли (PEG).
• Рентабельность капитала% — За последний квартал (после налогов): прибыль от общих операций (не включая чрезвычайные статьи), разделенная на собственный капитал за последний квартал.
• Рентабельность активов% — За последний квартал (до налогов): прибыль от общих операций (не включая чрезвычайные статьи), разделенная на активы за последний квартал.
• Маржа прибыли% — Показатель прибыльности за последний год, равный годовой чистой прибыли / выручке за выбранный период * 100.
• Чистая маржа% — Показатель прибыльности за последний год, равный годовой чистой прибыли / выручке за выбранный период * 100.
• Долг / собственный капитал — Соотношение заемных / собственных средств за последний квартал. Долг / собственный капитал — это коэффициент финансового благополучия, который добавляет долгосрочный долг к текущим обязательствам, а затем делит его на чистый капитал за последний финансовый год на акцию обыкновенных акций.
• Цена / Продажи — Последняя цена закрытия акций, деленная на доход / объем продаж на акцию за последние двенадцать месяцев.
• Цена / денежный поток — Последняя цена закрытия акций, деленная на доход / денежный поток за последние двенадцать месяцев на акцию.
• Цена за книгу — Финансовый коэффициент, используемый для сравнения текущей рыночной цены компании с ее балансовой стоимостью.
• Балансовая стоимость на акцию — Стоимость одной акции компании, основанная на ее собственном капитале, доступном для простых акционеров в течение последних 12 месяцев.
• Покрытие процентов — Мера способности компании выполнять свои процентные платежи.(Годовой доход до налогообложения + годовые процентные расходы) / Годовые процентные расходы

Полимиксин B-связывающая способность дикого типа S. marcescens и мутантов arn ….

Контекст 1

… не phoP-нокаут-мутант после заражения PB. Зная, что Serratia PhoP регулирует экспрессию оперона arn в ответ на уровни PB и Mg 2, мы проверили влияние предварительной обработки PB или Mg 2 на рост и выживаемость S. marcescens дикого типа, мутанта phoP и Штаммы [phoP (c)], дополненные phoP, после заражения PB.Мутант phoP, предварительно обработанный низкими дозами PB (1 мкг / мл) или низкими уровнями Mg 2 (0,1 мМ) в NMM (см. Материалы и методы), показал пониженные значения OD 600 в течение 7-часового периода после заражения 1000 Г / мл PB, но штаммы дикого типа и phoP (c) демонстрировали повышенный рост (фиг. 6A и B). Кроме того, мы выполнили анализ выживаемости PB, обработав бактериальные штаммы либо 1 мкг / мл PB, либо высоким уровнем Mg 2 (20 мМ) в бульоне LB, а затем провоцируя бактериальные клетки соответствующей дозой МИК PB для диких животных. type, мутант phoP и штаммы phoP (c).Показатели выживаемости штаммов дикого типа и phoP (c) снизились примерно до 20% от контроля без заражения путем предварительной обработки 20 мМ Mg 2 и были увеличены в 6 раз по сравнению с контролем без заражения посредством Предварительная обработка PB (рис. 6C). Напротив, обработка 1 мкг / мл PB или высокие уровни Mg 2 almost почти не влияли на выживаемость мутанта phoP (фиг. 6C). Вместе эти данные показывают, что 1 мкг / мл PB или Mg 2 может служить сигналом для защиты S. marcescens от заражения PB через PhoP-зависимый путь, который активирует экспрессию LPS-модифицирующего оперона arn.PhoP-зависимый путь. Ферменты, кодируемые опероном arn, ответственны за модификацию ЛПС с помощью Ara4N, а ген ugd необходим для биосинтеза Ara4N (5). Белок Ugd Salmonella, Yersinia и Proteus находится под контролем двухкомпонентного пути PhoPQ или RppAB в ответ на PB и / или Mg 2 ϩ (21, 31, 33). В этом отношении S. marcescens Ugd имеет 79% идентичности и 86% сходства с Y. pestis KM10 ϩ. Зная, что Serratia PhoP регулирует экспрессию оперона arn в ответ на PB, мы исследовали влияние PB на экспрессию ugd в S.marcescens, мутант phoP и штаммы phoP (c) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что экспрессия мРНК ugd индуцировалась PB в штаммах дикого типа и комплементарных штаммах, но не в мутанте phoP (фиг. 7). Наши данные показали, что гены arn и ugd могут отвечать на сигнал PB через путь PhoP, чтобы модифицировать LPS и вызывать устойчивость к PB у S. marcescens. клинических изолятов S. marcescens. Чтобы еще раз подтвердить значимость PhoP-зависимой экспрессии arn в устойчивости к PB, мы проанализировали экспрессию гена arnA с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени в клинических изолятах S.marcescens. Мы обнаружили, что уровни экспрессии были сопоставимы у PB-устойчивых и чувствительных изолятов в отсутствие PB; однако экспрессия arnA индуцировалась в 3-7,4 раза в присутствии PB в устойчивых к PB изолятов, но не в чувствительных (таблица 2). Способность S. marcescens выживать при убивающем действии ВП явно важна в патогенезе S. marcescens (27). Хотя некоторые исследования показали, что протеазы и модификация ЛПС необходимы для устойчивости к CAP у других бактерий (3, 4), молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости S.marcescens остаются полностью неизвестными. В этом исследовании мы выделили несколько мутантов, которые были более чувствительны к PB, чем дикий тип. Было обнаружено, что у двух мутантов Tn 5 встроен в гены arnB и arnC того, что, по-видимому, является аналогом оперона pmrF в S. enterica и E. coli (5, 28). Оперон arn у S. marcescens и Y. pestis фланкирован генами btuD (кодирует переносчик витамина B 12) и nlpC (кодирует гидролазу липопротеинов). Модификации ЛПС грамотрицательных организмов регулируются двухкомпонентными системами в ответ на условия окружающей среды (13, 33–36).У сальмонелл LPS-модифицирующий оперон arn индуцируется Fe 3, который воспринимается родственным PmrA сенсором PmrB, и низкими уровнями Mg 2 in таким образом, который требует PmrAB, Mg 2 ϩ-отвечающего PhoPQ и Белок PmrD (8, 31). E. coli индуцирует PmrA-зависимую резистентность PB в ответ на Fe 3 ϩ, но не реагирует на низкий сигнал Mg 2 из-за сильно дивергентного белка PmrD (37, 38). У P. mirabilis мы идентифицировали двухкомпонентный регулятор ответа (RppA) в качестве регулятора чувствительности к PB путем прямого контроля экспрессии pmrI (arnA) в ответ на PB (22).Здесь мы сообщаем, что PB и Mg 2 ϩ могут способствовать PhoP-зависимой экспрессии arn и устойчивости к PB у S. marcescens посредством прямого связывания PhoP в промоторе arn, несмотря на отсутствие белка PmrD. Сходным образом, у Yersinia pestis, лишенных PmrD, PhoP, как было показано, регулирует экспрессию оперона arn путем прямого связывания с промоторной областью оперона arn (33). Таким образом, виды бактерий могут использовать различные регуляторные пути для контроля генов, кодирующих консервативные белки. Более того, белки PhoP Salmonella и Yersinia запускают экспрессию ugd путем прямого связывания с промотором ugd (31, 33).Соответственно, мы обнаружили, что Serratia ugd находится под контролем PhoP в этом исследовании (рис. 7). Несколько линий доказательств указывают на то, что система S. marcescens PhoPQ, воспринимая PB и Mg 2, может регулировать экспрессию оперона arn для модификации LPS и приводить к устойчивости к PB. Во-первых, все мутанты phoP, arnB и arnC (t) проявляли PB-чувствительный фенотип, а штаммы phoP (c), arnB (c) и arnC (tc) демонстрировали MIC дикого типа. PB и низкие уровни Mg 2 защищали S. marcescens от заражения PB в штамме дикого типа и штамме, дополненном phoP, но не в мутанте phoP (рис.6). Во-вторых, анализ связывания PB продемонстрировал, что LPS мутантов arnB и arnC (t) обладают повышенной способностью связывания PB, что предполагает наличие определенных изменений LPS в мутантах (рис. 2). В-третьих, активности промоторов оперонов phoP и arn увеличивались за счет PB и низких уровней Mg 2 в штаммах дикого типа и штаммах, дополненных PhoP, но не в мутантах phoP (рис. 3 и 4). В-четвертых, EMSA показало, что PhoP может напрямую связываться с промоторами phoP и arn (рис. 5). В-пятых, экспрессия гена ugd, кодирующего предшественник Ara4N для модификации LPS, также увеличивалась в ответ на PB в штаммах дикого типа и phoP (c), но не в мутанте phoP (рис.7). Значимость arn-опосредованной устойчивости к PB была также продемонстрирована более высокой экспрессией arnA устойчивых к PB клинических изолятов S. marcescens по сравнению с чувствительными изолятами в ответ на PB (таблица 2). Присутствие консервативного сайта связывания PhoP в промоторе arn у различных видов Serratia (рис. 8) подчеркивает важность регулируемого PhoP пути arn в устойчивости к PB. Было продемонстрировано, что S. marcescens PhoPQ контролирует критические фенотипы вирулентности и участвует в адаптации к росту с дефицитом Mg 2 ϩ и в присутствии PB, которые представляют собой сигналы для активации системы PhoPQ (27).