Срок размещения на бус гов годовой отчетности

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Срок размещения на бус гов годовой отчетности (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Срок размещения на бус гов годовой отчетности Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Статья: Правила работы с отчетом о выполнении государственного (муниципального) задания
(Зайцева Г.Г.)
(«Руководитель бюджетной организации», 2019, N 1)Важно, что даты, установленные в конкретном государственном (муниципальном) задании и порядке формирования и финансового обеспечения выполнения задания, могут не совпадать. К примеру, в заданиях, выданных на 2018 год федеральным бюджетным образовательным учреждениям высшего образования (информация размещена на официальном сайте bus.gov.ru), указана дата сдачи отчетности «до 1 февраля 2019 года» (вместо общего срока до 1 марта). А бюджетные учреждения социального обслуживания Тульской области должны подавать годовой отчет до 25 января года, следующего за отчетным (вместо «до 15 февраля»). Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Статья: Готовим отчет о выполнении государственного (муниципального) задания
(Зайцева Г.)
(«Автономные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложение», 2018, N 12)Подчеркнем, что точный срок представления отчетности указывается в самом государственном (муниципальном) задании — именно на него и нужно ориентироваться автономным учреждениям. На практике эта дата наступает раньше, чем срок, установленный в порядке формирования и финансового обеспечения выполнения задания. Например, в заданиях, выданных на 2018 год федеральным автономным образовательным учреждениям (информация размещена на официальном сайте bus.gov.ru), указана дата сдачи отчетности до 1 февраля 2019 года (вместо «общего» срока до 1 марта). А автономные учреждения социального обслуживания Московской области должны подавать годовой отчет так же, как и квартальные, — до 5-го числа месяца, следующего за отчетным периодом (вместо 1 февраля).

Нормативные акты: Срок размещения на бус гов годовой отчетности

ООО «БУС ТЕХЦЕНТР «ОАЗИС ПЛЮС», ИНН 6727014705

НЕ ДЕЙСТВУЕТ С 15.10.2004

Общие сведения:



Контактная информация:

Юридический адрес: 215800, СМОЛЕНСКАЯ ОБЛАСТЬ, ГОРОД ЯРЦЕВО

Телефон:

E-mail:

Реквизиты компании:

Виды деятельности:

Основной (по коду ОКВЭД): 50.40.4 — Техническое обслуживание и ремонт мотоциклов

Найти похожие предприятия — в той же отрасли и регионе (с тем же ОКВЭД и ОКАТО)

Дополнительные виды деятельности по ОКВЭД:

50.10.1	Оптовая торговля автотранспортными средствами
50.10.2	Розничная торговля автотранспортными средствами
50.10.3	Торговля автотранспортными средствами через агентов
50.20.1	Техническое обслуживание и ремонт легковых автомобилей
50.20.2	Техническое обслуживание и ремонт прочих автотранспортных средств
50.20.3	Предоставление прочих видов услуг по техническому обслуживанию автотранспортных средств
50.30.1	Оптовая торговля автомобильными деталями, узлами и принадлежностями
50.30.2	Розничная торговля автомобильными деталями, узлами и принадлежностями
50.30.3	Торговля автомобильными деталями, узлами и принадлежностями через агентов
50.40.1	Оптовая торговля мотоциклами, их деталями, узлами и принадлежностями
50.40.2	Розничная торговля мотоциклами, их деталями, узлами и принадлежностями
50.40.3	Торговля мотоциклами, их деталями, узлами и принадлежностями через агентов
51.65.1	Оптовая торговля транспортными средствами и оборудованием
51.65.2	Оптовая торговля эксплуатационными материалами и принадлежностями машин и оборудования
52.46.2	Розничная торговля красками, лаками и эмалями
60.21.11	Внутригородские автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.21.12	Пригородные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.21.13	Междугородные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.21.14	Международные автомобильные (автобусные) пассажирские перевозки, подчиняющиеся расписанию
60.22	Деятельность такси
60.23	Деятельность прочего сухопутного пассажирского транспорта
60.24.1	Деятельность автомобильного грузового специализированного транспорта
60.24.2	Деятельность автомобильного грузового неспециализированного транспорта
60.24.3	Аренда грузового автомобильного транспорта с водителем
63.11.1	Транспортная обработка контейнеров
63.11.2	Транспортная обработка прочих грузов
63.12.4	Хранение и складирование прочих грузов
63.21.21	Деятельность терминалов (автобусных станций и т.п.)
63.21.22	Эксплуатация автомобильных дорог общего пользования
63.21.23	Эксплуатация дорожных сооружений (мостов, туннелей, путепроводов и т.п.)
63.21.24	Эксплуатация гаражей, стоянок для автотранспортных средств, велосипедов и т.п.
63.30.1	Организация комплексного туристического обслуживания
63.30.2	Обеспечение экскурсионными билетами, обеспечение проживания, обеспечение транспортными средствами
63.30.3	Предоставление туристических информационных услуг
63.30.4	Предоставление туристических экскурсионных услуг
63.40	Организация перевозок грузов
71.21.1	Аренда прочего автомобильного транспорта и оборудования
71.34.1	Аренда двигателей, турбин и станков
74.70.2	Чистка и уборка транспортных средств

Учредители:

Регистрация в Пенсионном фонде Российской Федерации:

Регистрационный номер: 076027060029

Дата регистрации: 02.03.2004

Наименование органа ПФР: Управление Пенсионного Фонда Российской Федерации в Ярцевском районе Смоленской области

ГРН внесения в ЕГРЮЛ записи: 2056715155253

Дата внесения в ЕГРЮЛ записи: 13.05.2005

Регистрация в Фонде социального страхования Российской Федерации:

Регистрационный номер: 670440109967021

Дата регистрации: 03.03.2004

Наименование органа ФСС: Филиал № 2 Государственного учреждения — Смоленского регионального отделения Фонда социального страхования Российской Федерации

ГРН внесения в ЕГРЮЛ записи:

Дата внесения в ЕГРЮЛ записи: 03.11.2004

Госзакупки по 44-ФЗ не найдены

Госзакупки по 223-ФЗ не найдены

Арбитраж: Сертификаты соответствия: Исполнительные производства:

Краткая справка:

Организация ‘ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ»БУС ТЕХЦЕНТР «ОАЗИС ПЛЮС»‘ зарегистрирована 01 марта 2004 года по адресу 215800, СМОЛЕНСКАЯ ОБЛАСТЬ, ГОРОД ЯРЦЕВО. Компании был присвоен ОГРН 1046713001202 и выдан ИНН 6727014705. Основным видом деятельности является техническое обслуживание и ремонт мотоциклов. Компанию возглавляет ИВАНОВ ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ. Состояние: ЛИКВИДАЦИЯ ЮРИДИЧЕСКОГО ЛИЦА.

Добавить организацию в сравнение

Бусы — Авторевю

Еще вчера ты с улыбкой собирал штрафы на своем купе BMW третьей серии. Жена иногда ворчала на тесноту, но все же места вам и маленькому ребенку хватало. Однако теперь у тебя двое детей, в смысле еще двое — плюс двойня! Значит, пришло время узнать, что бусы — это не всегда женское украшение.

Итак, выбираем автобус для большой семьи: свежий Citroen SpaceTourer или ветеран Hyundai H-1? А если вам трудно сосчитать не только детей, но и деньги, то ваша пара — Volkswagen Multivan и Mercedes V-класса. Два мира — два детства?

Много детей

Я давно знаю его как Grand Starex — это корейское имя Hyundai H-1. Лет семь назад я много ездил на этом микроавтобусе и был приятно удивлен. Отличная трансформация, хорошая тяга дизеля — и неубиваемость. Да, мотор 2.5 (170 л.с.) у ранних автомобилей пугал лопающимся коленвалом, но это в прошлом: больше ломаться в Старексе, то есть в H-1, нечему.

Hyundai H-1, конечно, не дрифтмобиль, но если очень хочется, то… Может!

А вот бедность комплектаций H-1 у официальных российских дилеров Hyundai, увы, осталась. Рестайлинг в этом смысле не помог, и H-1 на фоне купейного вагона Старекса просто электричка. Вместо индивидуальных кресел на втором ряду лавка, которую можно двигать вперед-назад и у которой в небольшом диапазоне меняется угол наклона спинки, а третий ряд и вовсе жестко прикручен к полу (небольшая подвижность есть только у спинки). Да, если ваша задача возить много людей и вещей, то сгодится и это, недаром бусы Hyundai работают маршрутками. Но использовать подобные автомобили хочется гораздо шире! Путешествия, вылазки на природу, а в H-1, даже вооружившись гаечными ключами, приличное спальное место не сделаешь. С ностальгией вспоминаю Grand Starex, у которого задний диван раскладывался в отличную кровать

Полная версия доступна только подписчикамПодпишитесь прямо сейчас

я уже подписан

Work in Progress :: Чем я занимаюсь последние два месяца каждые выходные :: Вастрик.ру

Поганый идеализм всю жизнь запрещает мне показывать половину работы. Однако, для больших проектов типа постройки буса это оборачивается затишьем на месяцы и слухами, что я сдох. Сдох я пока только внутри, а с идеализмом надо как-то бороться.

Напомню, что в прошлой серии мы купили бус где-то в деревне под Чехией и решили строить из него машину для путешествий. Потому что антипрививочники всё равно побеждают, границы в пятый раз закрывают, а наши «одобренные ЕС» ковид-паспорта уже становятся бесполезными бумажками из-за новых мутаций вируса. ? С этой недели, например, возвращаясь из Португалии и России ты всё равно обязан сидеть карантин, даже если привит Пфайзером

Кек. Новая реальность.

Последние два месяца я проводил свои выходные за кручением гаек и прокладыванием проводов в гараже. Кажется, к 30 годам каждый мужчина на генетическом уровне обзаводится гаражом. Часики-то тикают.

Жаль пока не своим. Ведь у нас тут европа, городская среда, органические велодорожки, а не эти твои бумерские замашки. Но нам повезло найти хороших ребят в Берлине, которые не только помогали мне крутить самые труднодоступные гайки за вменяемые деньги, но еще и разрешали приезжать к ним по выходным чиниться и разжигать BBQ сжатым воздухом.

Такой человеческий подход в Германии скорее всего нелегален, потому контакты оставлять не буду, но если кому надо, у нас теперь есть Клубный автосервис в Берлине, обращайтесь за рефом.

Дальше обо всём по порядку.

БУУУУСЫ

Итак, у нас на руках была маршрутка с 9 сиденьями. Типичный Volkswagen T5 Caravelle. Признаюсь, сначала у меня была смутная надежда все их продать и отбить на этом пару тысяч евро. Ведь они КОЖАНЫЕ, ну! Бохато!

К сожалению, рыночек оказался умнее моих наивных попыток корчить из себя предпринимателя (в принципе, как и всегда). Потому одиночные тряпочные сиденья от California могли запросто стоить €1000+ за штуку, а твои «модные кожаные» диваны никому не нужны даже за €500 все вдевятером.

Утрирую, конечно, но по факту с продажи всех сидений мы по-моему отыграли максимум косарь, уже хорошо. Но там были схемы с трейд-инами и обменами, так что сложно прям посчитать.

Пака, старая лавка

Так как процесс продажи небыстрый, а наша квартира вдоволь засралась автозапчастями, мы начали складировать ненужные сиденья по подвалам друзей. Тут в Германии часто выдают комнату в подвале (келлер) как кладовку к вашей арендованной однухе, однако у многих они пустуют потому что оттуда постоянно всё пиздят бомжи.

Грех было не использовать социальные контакты!

Когда все сиденья были вынуты, а фронт работы тщательно проанализирован, стало отчетливо ясно, что мы в жопе, капитан. Предстояла полная переделка из Caravelle в Multivan, который новым стоит 1.5 раза дороже.

Плюс непонятно как к такой хуйне отнесётся немецкий TÜV (техническая инспекция), который тут всему бог и судья.

Немцы (как и мы) обожают всё вокруг ЗАПРЕЩАТЬ, так что на входе в любой парк тут висит до 15 табличек КАКЕН ФЕРБОТЕН, а у себя на даче вы даже беседку не можете легально поставить без лицензии. ? Даже пёс на заглавном фото носит свою «лицензию» на ошейнике 😀

Соседи стуканут и депортация нахер (нет).

Представляете что нам грозило за такую дерзость с транспортным средством?

Мы уже морально приготовились проходить транспортную экспертизу заново. Благо это недорого, 100-200 евро, ведь настоящие немцы каждый свой сраный DIY носят лицензировать в TÜV, тут всё поставлено на поток.

Самым большим отличием нашей Caravelle от божественного Multivan было крепление сидений к полу. У фольцвагена на протяжении десятилетий есть два типа креплений: «клик-система» для нищих и «рельсы» для богачей.

Вот так выглядит клик-система:

А так рельсы от мультивана:

Так вот рельсы на порядок универсальнее — в них можно воткнуть что угодно, плюс сторонние производители делают под них свои штуки. Клик-же-система — удел отвратительных нищеёбов, которая не позволяет поменять вообще ничего, кроме её нещадного выбрасывания.

Догадайтесь какая система досталась мне с моей жизненной удачей)))0))))

Ну штош. Задним умом мы все умненькие, мог бы и подольше погуглить, не месяц потратить на рисёрч перед покупкой, а два, ну. Не на трёх языках гуглить информацию, а на пяти.

Ты разве не знал, что на вон том латышском форуме ребята давно всё раскидали!

Но жизнь она всегда такая, нужно как-то уметь крутиться с данными нам несовершенствами. Ищем новый пол.

Сначала мы для теста съездили в корона-трип по Швейцарии через секретные тропинки, по которым местные ввозят килограммы дешевого мяса из немецкого Lidl.

Уже на них стало понятно, что с текущими сиденьями жить нельзя, надо ставить полноценную раскладную кровать.

Для этого нужна, собственно, кровать, по типу как у Калифорнии:

И вот такой пол с рельсами:

Всё остальное никогда бы не прошло немецкий TÜV. Мы же планировали легально возить с собой +2 друзей, так что морально были готовы искать именно фирменные фольцвагеновские штуки и переплачивать.

Поиск оказался самым сложным этапом. Мы наивно тыркались по каким-то мутным полякам, обещавшим нам всю помощь мира, но в итоге пропадавших на полпути. Отбивались от немецких рендеков, грозивших засудить нас, ебучих мигрантов-унтерменшей, за то, что приехали смотреть товар и отказались его покупать.

До сих пор жду повестки.

Мы даже написали официальный запрос дилеру Volkswagen, который спустя месяц ответил нам, что детали с такими номерами не существуют в базе, ты куда звонишь вообще! ? Конечно же, такие детали существовали, просто так работает любая бюрократическая машина — ничего не делает, но притворяется, что ты в этом виноват

Ну и молчу про ковид, из-за которого вся частная торговля внутри Европы попросту остановилась, остался лишь Амазон с Безосом, который на заработанные с пандемии миллиарды теперь вон в космос летит.

Короче, поиски пола и сидений заняли без шуток полгода. В декабре 2020 мы начали и примерно в апреле 2021 что-то нашлось. Не того цвета, но уже было насрать.

У нас была отличная лавка от комплектации Beach вместе с тумбочкой и задней лежанкой. Посылку в 100кг привёз нам домой доброжелательный поляк на газельке прямо в разгар закрытых границ. Даже помог перегрузить её в наш бус.

Так мы с ней и ездили пару месяцев пока искали к ней подходящие рельсы от Мультивана.

Как и ожидалось, это была самая дорогая часть всей переделки. Калифорнии на рынке нарасхват как пирожки в столовке, потому что цены на их комплектующие соответствующие. Наша лавка обошлась нам в ужасающие €2500 и это была еще хорошая сделка. Обычно их моментально раскупают даже по €3-5К.

Пол с рельсами обошелся дешевле, что-то типа €800. Ух, ладно, всё-таки хобби вроде как для того и нужно чтобы тратить на него деньги.

Напоминаю, что опция «сварить всё из ржавых труб за гаражами» не рассматривалась, потому что задача была легально возить там пассажиров и пройти техинспекцию в самой суровой по техинспекциям стране мира.

В день Х всё закупленные сиденья, рельсы и пол были доставлены в сервис. Вот тебе подъемник, ключ на 16 и Радио Дача. Теперь ты автомеханик.

Разбирать пришлось действительно дофига. Сначала я думал, что мы просто снимем пол, открутим старые крепления, вбросим рельсы и поедем в закат. Ага, как бы не так.

Чтобы вынуть пол нужно снять всю обшивку интерьера, которая его держит, а сами же крепления сидений оказались прикручены не изнутри, а снизу автомобиля. То есть чтобы добраться до болтов нужно открутить топливный бак (а там 90 литров дизеля!), опустить кардан, снять глушитель, запаску — короче только на откручивание гаек ушло два полных дня.

А мог бы сидеть микросервисы в пубернетесе программировать!

Лишние дырки от старых креплений пришлось заливать герметиком, а все железные поверхности обклеивать шумкой. Ну хоть тут Фольцваген не устроил нам подстав и рельсы встали в кузов без напильника и практически в те же дырки.

Некоторые детали, естественно, в процессе было нахер поломаны, но без этого в нашем деле вообще никуда.

После закупки новых поломанных деталей, на прикручивание всего добра обратно ушло еще три дня.

Теперь у нас был пол:

И новая лавка:

По дороге всё было изнутри обклеено кубометрами шумоизоляции. Чёрное на фотках — это её второй слой, а оранжевое — первый. Ещё поставлены новые колонки, потому что хорошая акустика и музыка в долгой дороге это вообще самое важное.

Но этот нудный процесс я даже показывать не буду, очень уж тупо, нудно и долго. Нам нужен ЭКШОН!

Когда ко всему этому добру мы стали обратно примерять пластиковые обшивки салона, внезапно выяснилось, что пол стал выше на 1 см и весь остальной интерьер больше к нему физически не подходит 😀

Ну ты и рукожоп, Вастрик, а мог бы опять нагуглить всё заранее, на том латышском форуме это тоже было!

Штош, было решено пилить стены. Срезать у каждой снизу по сантиметру и надеяться, что встанет и не будет мешать остальным диванам. Ну а новые пороги и ступеньки были найдены по дешевке на польских разборках.

Пилим детали интерьера лобзиком Чудом впихиваем их на место

Похоже, за время постройки буса я выучил польский как минимум на А2.

Короче, жилплощадь была наконец-то в сборе и выглядела примерно так.

Пока это нас устраивало. Мы не хотим тут ВАНЛАЙФ, нас до сих пор даже смущает идея кухни внутри, нам просто нужен был некий минимум чтобы начать ездить и понимать что дальше строить.

Оставалось дело за электрикой.

Хотелось как-то заряжать телефоны ночью, ну и чтобы свет в салое включался по кнопке, а не каким-то случайным одному лишь фольцвагену ведомым образом от открытия-закрытия дверей.

Автомобильные аккумуляторы ненавидят долго что-то питать. Так уж они устроены — с радостью выдадут вам сотни ампер в пике, но стоит им немного разрядиться хотя бы до 80% и вы уже не заведётесь.

За полгода так случалось аж два раза, приходилось вызывать таксиста прикурить, а они в Германии по наглости и скупердяйству на втором месте после риелторов.

? Если в Литве таксист прикуривал за €5 и вдобавок оставлял тебе свой номер чтобы если что ты звонили ему напрямую, то в Германии турок на новом E-classe даже из приоткрытого окошка будет клянчить минимум €25 и приговаривать, что это «фест прайс фест прайс». То есть никакой другой таксист тебе дешевле не поможет, друг, ибо мы все тут договорились в профсоюзе, а частников запретили. Так работают картели. Велкам ту европ.

Было решено ставить вторую батарею из лития, они же LiFePO4. Почти как в твоём айфоне, только пожирнее.

Литиевые батареи идеальны для юзкейсов типа «стоим и медленно разряжаемся» и «едем и медленно заряжаемся», плюс живут дольше и компактнее, что важно для маленького буса.

Их главный минус — цена. Даже на текущем уровне прогресса, готовьтесь переплатить €400-800 за литиевый аккумулятор средней ёмкости вместо привычных €100-200 за автомобильный.

Я взял батарею у ребят из GreenCell. Снова поляки, да что ж такое, весь бус будет польский похоже!

Вторую батарею надо как-то заряжать. Солнечные панели ставить пока рано, там сначала багажник нужен, потому было решено бросать жирный красный провод от основной батареи и заряжать вторую на ходу реле раздельной зарядки.

Split Charging Relay + Cut out Switch

Очень простая штука, по сути автоматический кран. Когда напряжение на первом аккумуляторе становится больше 13.3V — замыкает контакт, ток начинает течь и во второй аккумулятор тоже. Когда падает меньше 12.6V — размыкает, обе батареи начинают жить независимо. Можно хоть в ноль высадить вторую батарею, а первая при этом останется нетронутой. Утром завёлся и поехал. Красава.

Вот так соединяем

Конечно, всё было жирно обложено предохранителями по 50 Ампер и толстенными проводами, которые оказалось не так-то просто найти в обычных магазинах. Никогда раньше об этом не задумывался, но для постоянного тока провода должны быть прям жесть какие жирные — в разы толще, чем для переменного.

Реально с палец толщиной, а ведь нужно «всего» 50 Ампер

Чтобы всё не улетало на поворотах, был выпилен УНИКАЛЬНЫЙ кейс из старой картины с совушками, которую я нашел на берлинской помойке. Правда, прессованный ДВП оказался не самым надёжным материалом, потому скоро перевыпилю его из нормальной фанеры.

На кейс прикручен блок предохранителей, разводящий 12 вольт на всякие лампочки, USB-розетки и панели. В целом стандартно, ничего интересного.

---

Из неожиданных особенностей такого электросетапа оказалось, что если обе батареи хорошенько заряжены (реле замкнуто даже при выключенном двигателе), то и расходоваться они будут одновременно. Включённое радио в машине или вентилятор теперь может работать весь вечер пока ОБА аккума не упадут ниже 12.6V (что заметно дольше одного), после чего реле отщёлкнет обратно и девайсы начнут резко высасывать только автомобильный аккум, если за ними не уследить. Это забавно. Не знаю должно ли так быть или я снова накосячил.

В остальном электрика оказалась весёлым занятием. Обжимаешь коннекторы, обматываешь косы тряпичной лентой, протягиваешь под обшивками, материшься.

Как-то так выглядит всё собранное и подписанное Лена плетёт косички Всратая панель управления (надеюсь хоть она не загорится) Вот как-то так получилось. Ой

Окей, у нас есть дополнительный аккумулятор на 100Ah, но нахера?

При стандартных 12.5V, его нам хватит на 12.5V 100Ah = 1250 ваттчасов.

В переводе на бытовые вещи, если зарядка макбука потребляет 40-65 ватт, этого хватит на 1250 / 65 = 20 часов гейминга на максималках, либо на 1250 / 5 = 250 часов = 10 дней зарядки айфонов при стандартных 5 ваттах. Короче, на моих юзкейсах, это бесконечность. Я не останавливаюсь так надолго в одном месте.

Можно было смело брать 50-80Ah, но куда уж теперь. Задним умом я снова умён. Будем ставить что есть.

Единственное годное место для установки второго аккумулятора в T5 — под сиденьями. Водительским или пассажирским. В калифорниях их ставят именно там и оно неспроста.

У нас же были нищебродские сидушки от маршрутки, где спереди 1+2=3 сиденья. У водителя нет подлокотников, а пассажир вообще вынужден страдать на двух половинках, что тяжеловато когда едешь 1000+км одним махом. Плюс они все были кожаными, а это хоть и модно, но отвратительно — кожаные сиденья летом раскаляются как сковородка, а зимой их хер прогреешь.

В планах всё равно была их замена, а тут попался отличный вариант. У поляков, конечно же. Которые согласились выкупить наши старые сиденья в цену тех, плюс установили их прямо на парковке, где мы и встретились.

Идеально. Хотя и снова минус €1000+ в кошельке.

Затрейдинили старые сиденья на новые

Зато теперь есть два огромных «капитанских» сиденья с личными подлокотиками у каждого. Как в ренжровере. Плюс оба разворачиваются в салон, что заметно увеличивает полезную площадь буса. Так что, думаю, оно того стоило.

На этот раз даже в цвет получилось

Неочевидным, но полезным гаджетом оказался термометр, который показывает температуру внутри и снаружи с помощью проводного датчика. Оказалось весьма полезно, не хватает еще часов.

Внутри холоднее — слава второму кондею в салоне!

Очевидным же с самых первых дней гаджетом было крепление для велосипедов на хлопушку багажника. Не только потому что возить с собой велосипеды — офигенно, но еще на ней можно сушить вещи на стоянках, а в долгих походах использовать как дополнительный багажник для хлама или канистр с топливом.

Внешний багажник позволяет возить с собой больше любимых средств передвижения!

Ну и последний шик — держалка для айпада для просмотра киношек. Не представляю как и кто её будет использовать, но выглядит-то как!

Пассажирам красиво! Лежать тоже норм. У тебя и свет есть и даже дует сверху Сзади есть такой стол чтобы разделять тебя от багажа

После всех ненужных апгрейдов мы решили наконец-то вывозить наш передвижной сетап поля. Сначала катались в дей-трипы с великами по холмам приберлинья, пару раз выбирались с ночёвкой на море, смотреть на закат и стройку Северного Потока 2 можно бесконечно. А неделю назад вот даже выбрались на выходные по горам и деревням Саксонии.

Всё это можно считать тестовыми вылазками, о которых никто обычно не рассказывает. Мы тоже абсолютно не знали каково это — ночевать в машине в лесу.

По сути это как в палатке. Ты засыпаешь при жаре +30, а ночью просыпаешься от холода в +5-10, всеми силами пытаешься согреться, чтобы потом в 8 утра снова проснуться в луже пота внутри нагревшего до +50 от утреннего солнышка автобуса, потому что ты неправильно рассчитал угол рассвета и тень от ближайших деревьев совсем не накрывает тебя так, как ты хотел.

Потом выясняется, что когда солнышко разогревает привычные тебе вещи до +50-60 градусов, они могут начать проявлять необычные тебе свойства. Экраны гнуться где не стоило бы, а самый крутой супер-пупер-клей 3М попросту отклеиваться. С домашними вещами такого обычно не случалось!

В итоге нашими первыми коварными врагами стала не тряска и вибрация, как мы думали вначале, а именно температуры разогревающегося корпуса буса.

Гуси одобряют

Интересный опыт. Жаль я дурачок и познаю всё это с нуля на своей шкуре, несмотря на десятки часов чтения интернетов. Ну может хоть комменты к этому посту мне чем-то помогут.

Всё это войдёт в большой пост про настоящие путешествия, который скорее всего выйдет осенью, но самыми ранними лайфхаками поделюсь уже сейчас. Вдруг кому-то это еще не очевидно (как и мне).

Канистра с водой — мастхев

Среди кемперов тут популярны складывающиеся канистры для питьевой воды. Типа таких:

Сначала я недооценивал их прелесть, думая, что как обычно обойдусь пятилитровками с заправок. А вот нет. При своей копеечной цене эти штуки отбиваются на раз.

Мы взяли на 10 литров, но можно смело брать на 15-20. Летом за сутки мы расходуем примерно 5 литров воды на двоих, плюс наши личные бутылочки и термосы с кофе. Короче, вода — это жизнь, надо больше воды.

При желании фляжка легко пополняется, а когда не нужна — складывается в ноль и не занимает место. Мастхев.

Я раньше не знал, мне показали друзья, но это теперь мой любимый тревел-гаджет.

Наши предки в турпоходы брали с собой котелки, которые тщательно устанавливали над костром, чтобы разогреть в нём немного воды или каши. Так вот JetBoil это такой котелок 21 века.

Ты накручиваешь его на газовый баллон (продаётся на любой заправке), заливаешь в него воду, жмешь кнопку с искрой, и через 2-3 минуты у тебя есть литр кипятка. Быстрее, чем чайник!

Одного мини-баллона с газом хватит на годы при нашем нечастом его использовании по утрам.

Полученный кипяток отлично подходит для заварки чая или кофе в аэропрессе. Можно забросить в сам джетбойл кашу, суп или сосиски (рискуя его заговнить, конечно, но кого это когда-то волновало!). Есть даже версия с дырочкой для френч-пресса. Короче, идеальный хипстерский кемпинг. Всем айтишникам обзавестись, несмотря на высокую цену (~€100), оно того стоит (а я редко так говорю, обычно ною как дорого).

Если без чистой воды и кипятка вы ещё сможете как-то переночевать, то без оконных закрывашек на окна будет тяжеловато.

Я купил целый рулон фольгированного утеплителя и две недели зимой ходил примерял шаблоны и вырезал по форме. Получилось офигенно! Магазинные закрывашки никогда не подойдут так идеально к каждому окну.

Летом они спасают от беспощадного утреннего солнца, разогревающего автомобиль и все его внутренности до +50 градусов (с ними внутри будет где-то +32), а зимой они помогают сохранить тепло от ваших выдохов и тел внутри. То есть дарят вам где-то +5-10 бонусных градусов цельсия.

Единственный минус — занимают много места в багаже. Так что всякие шторы тоже пойдут для боковых окон. На лобовое же придётся что-то думать.

Неожиданное умение — парковаться в строго горизонтальном положении.

Городские жители сейчас недоумевают, но в лесу или на берегу моря это реально челленж. Если вы собираетесь спать в машине — вы должны её поставить максимально ровно по всем измерениям, иначе во сне вы просто будете скатываться в сторону даже небольшого уклона.

Не смейтесь, это реальная проблема! Она может разрушить вашу семью!

Современные дорогие кемперы даже имеют специальные гидравлические домкраты (прямо как на спорткарах для пит-стопов!) чтобы вставать ровно на любой поверхности.

Нам же такие богатства недоступны, потому просто советую несколько раз поэкспериментировать.

Автономный отопитель, он же фен, короче такая дизельная штука, которая дует вам тёплым воздухом в салон даже ночью или лютой зимой, когда двигатель выключен.

Планар превращает ваш маленький бус в Освенцим примерно за 5-10 минут работы, а потребляет меньше 0.1 литра дизеля в час, что просто мастхев для зимних ночёвок.

В северных регионах России зовётся «вебастой» по аналогии с популярным немецким производителем Webasto, однако родной самарский Планар 2Д справляется с задачей лучше и дешевле.

Я даже специально катался в Москву чтобы купить и привезти его в Германию, ведь здесь такое удовольствие обошлось бы под €1500 с установкой.

Ожидал особой жесткости на досмотрах в Шереметьево, но никто даже не заинтересовался. Три раза меня просили включить Макбук, ведь ВДРУГ ЭТО БОМБА, но когда я говорил «вот у меня еще есть дура с проводами…» махали рукой и говорили проходите, не задерживайте очередь.

Так операция с Планаром завершилась успехом.

Вангую, он нам очень поможет. Не только лютой зимой, но даже в межсезонье, когда днём вроде бы и +15, а ночью температура спокойно опускается до нуля, что никто из городских жителей обычно не замечает, но вот в лесу это может быть очень даже печально.

Ставить буду под второе сиденье, пассажирское, но уже ближе к осени. Боже храни дизель! (прости, Грета, я уже заплатил свои налоги на экологию, отъебись от меня)

Забыл рассказать как мы загорелись. Прям по взрослому, с коротким замыканием и дымом.

Короче, однажды вечером на кемпинге где-то в Саксонии мы добыли халявный местный гриль, пивасик, музыку, короче всё было по кайфу. Лена воткнула свой айфон в новенькую USB-розетку около сидений, а мы тусили где-то снаружи, наблюдая закат.

В один прекрасный момент мы решили заглянуть в багажник за новым винишком и учуяли весьма триггерящий запах. Запах горелой проводки невозможно спутать, вот прям совсем. Даже с грилем.

Багажник был резко брошен, а мы побежали внутрь. Из розетки с айфоном валил дым. По-моему Лена даже быстрее меня догадалась, что под водительским сиденьем у нас стоит прерыватель массы, обесточивающий весь бус одним движением.

Я всю жизнь не доверяю свои поделкам с электричеством, так что всегда ставлю такую штуку на видном месте.

Бус был обесточен, дым прекратился. Случись такое ночью — было бы два смешных трупа.

Даже предохранитель не помог. Он просто не сработал. Буду теперь ставить везде 5А, даже не смотря на то, что сам Фольцваген ставит на прикуриватели 15А.

Только спустя три дня я залез под обшивку и увидел, что загорелись не мои провода и коннекторы, а сам корпус USB-розетки с Амазона, из которого пузырями испарялся пластик. Фотку может попозже приложу, не смог подлезть телефоном.

Короче, Амазон в очередной раз оказался хуже Алиэкспресса.

Окей, пусть тут будет очередная тирада про поделие Безоса, которое с годами становится хуже, чем все его китайские, российские и даже польские копии.

Амазон сейчас на 80-90% завален китайским говном, скамом и подделками под бренды, а у покупателя почти нет шансов понять что ты покупаешь. Даже Алиэкспресс показывает кучу информации о продавце вплоть до его контактов, а Амазон всё тщательно прячет, ведь ему виднее, а то вдруг ты на сайт продавца уйдешь!

Китайские говнопродавцы давно поняли как в этом царстве рекомендательных алгоритмов Амазона выходить в топы и воровать чужие листинги. Они процветают. Регают тысячи аккаунтов, угоняют неактивные, накручивают себе сотни пятизвездочных отзывов и засирают все популярные запросы скамом.

Но если говно с Алиэкспресса хотя бы стоит копейки и всем понятно, что оно говно, то на Амазоне точно такое же говно пихают тебе за $20 вместо $1.5 с плашкой Amazon Choice и якобы европейскими сертификатами качества.

Я понимаю, что Амазон лишь маркетплейс, витрина. Я бы сам встал на их сторону, будь это единичные случаи, которые не заметили модераторы. Амазон же целенаправлено пушит тебе в лицо это говно с лычками Sponsored, Featured, Amazon Choice, опуская честные хорошие магазины вниз. И нет ни одной кнопки отключить это.

Короче, Амазон превратился в западный Алиэкспресс, только хуже. А что еще печальнее, что ему здесь нет альтернатив и я всё равно буду продолжать им пользоваться.

Пойду напишу им в саппорт про пожар, вдруг мне дадут промокод на €10 на прайм-дей!!!!111 Вииии!

Ну и посоветуйте плез нормальных производителей вот таких вот розеток и панелей с кнопками как на фотках выше. С удовольствием поменяю в будущем.

Держите напоследок нашего друга-цветочка (он на магнитике чтобы не летал на поворотах) и лего-пёсика из Netto чтобы как-то расслабиться

Очень хочется в Евротрип 🙁

Но очередная смена работы не способствует отпускам, так что от «весной достроим и сгоняем» мы уже проехали станцию «ну как-нибудь летом» и теперь готовимся к «осенью уже тогда давай».

С другой стороны, после каждого тестового трипа я нахочу новый десяток проблем, которые надо исправлять. То ключи от буса ночью некуда положить, то скотч от оконных закрывашек отклеивается, то вот горим нахер.

Этот пост был нужен как промежуточный отчёт о происходящем, но где-то осенью выйдет еще один, уже с нормальным фотками и полноценными трипами, где будет реальный опыт и обзор того, что сработало, а что нет.

Так что ожидайте.

••upd:•• кстати, залетайте в наш Бусочат

Mercedes-Benz V-Класс: вдохновение

Благодаря опциям для повышения комфорта, безопасности и универсальности можно оборудовать свой автомобиль V-Класса с учетом индивидуальных потребностей и предпочтений.

Выбор опций:

· Панорамная крыша со сдвижным люком обеспечивает салон светом и свежим воздухом и создает приятную светлую атмосферу.

· Центральная консоль со встроенным холодильником своими двумя термоподстаканниками, мультимедийным боксом, подлокотником и различными вещевыми отсеками подчеркивает атмосферу роскоши, как в легковом автомобиле.

· Сиденья люкс в 1-м заднем ряду слева и справа побалуют функциями массажа, кондиционирования и спального места и создадут в салоне V-Класса атмосферу максимального комфорта.

· Рейлинговый держатель обеспечивает быстрое и вариативное крепление различных систем крепления груза Mercedes-Benz.

· Идеально для использования планшета в задней части салона: к элементам подготовки под установку систем развлечения и комфорта относится USB-разъем питания.

· Использование пакета элементов освещения салона позволяет с помощью различных функций освещения визуально и функционально облагородить интерьер в темноте.

· Пакет зеркал с автоматическим затемнением и подсветкой пространства вокруг автомобиля повышает уровень комфорта.

· Задняя откидная дверь EASY-PACK автоматически открывается и закрывается простым нажатием кнопки

· Передние сиденья с электрорегулировкой имеют удобные возможности регулировки и практичную функцию памяти

· С помощью набора кабелей Media Interface в концепцию управления и индикации автомобиля можно интегрировать портативные устройства

· Светодиодная подсветка салона создает благородную атмосферу (либо в кабине и задней части, либо только в кабине) благодаря возможности настройки 3 цветов и 5 уровней яркости.

· Акустическая система объемного звучания Burmester® впечатляет великолепным звучанием на всех местах.

МТБанк — Банк свежих решений

НаличныеПо картамКурс НБ РБ

МинскБарановичиБобруйскБрестВитебскГомельГродноЖодиноЛидаМогилёвМозырьМолодечноСветлогорскСолигорск

Расчетно-кассовый центр №68, Центр банковских услуг «Корпоцентр»Удаленное рабочее место №239Расчетно-кассовый центр №42Расчетно-кассовый центр №74Расчетно-кассовый центр №37Расчетно-кассовый центр №29Расчетно-кассовый центр №50Расчетно-кассовый центр №65Расчетно-кассовый центр №53Расчетно-кассовый центр №63Расчетно-кассовый центр №54Расчетно-кассовый центр №35Обменный пункт №10Обменный пункт №60Обменный пункт №63Обменный пункт №62Обменный пункт №61 Обменный пункт №59 Обменный пункт №58 Обменный пункт №57Обменный пункт №27Обменный пункт №32Обменный пункт №56Расчетно-кассовый центр № 71Расчетно-кассовый центр №70 ПортРасчетно-кассовый центр №69Расчетно-кассовый центр №67 ФаренгейтРасчетно-кассовый центр №60Расчетно-кассовый центр №51Расчетно-кассовый центр №44Расчетно-кассовый центр №39Расчетно-кассовый центр №25Расчетно-кассовый центр №24Расчетно-кассовый центр №21Расчетно-кассовый центр №15Расчетно-кассовый центр №13Расчетно-кассовый центр №11Расчетно-кассовый центр №2Центр банковских услуг №3Обменный пункт №55Обменный пункт №54Обменный пункт №53Обменный пункт №52Обменный пункт №46Обменный пункт №43Обменный пункт №42Обменный пункт №19Обменный пункт №38Обменный пункт №28Обменный пункт №21Удаленное рабочее место №241Удаленное рабочее место №240Удаленное рабочее место №208Расчетно-кассовый центр №66Расчетно-кассовый центр №64Расчетно-кассовый центр №58Расчетно-кассовый центр №55Расчетно-кассовый центр №47, Центр банковских услуг № 9 «Победа»Расчетно-кассовый центр №45Расчетно-кассовый центр №1, Расчетно-кассовый центр №40Расчетно-кассовый центр №38Расчетно-кассовый центр №36, Центр банковских услуг «Парус»Расчетно-кассовый центр №32Расчетно-кассовый центр №30Расчетно-кассовый центр №22Расчетно-кассовый центр №19Расчетно-кассовый центр №8Центр банковских услуг №6

Основы фотографии. 2 ступень / Галерея работ / Fotoshkola.net

16.12.2015, 23:24

Юрий Притиск,
преподаватель

Светлана!

Здравствуйте!

Оценка работы

Спасибо за работу! Спасибо за комментарий и творческий поиск!

Очень оригинальный вид с развитым рисунком светотени и в целом, вид воспринимающийся неоднозначно.

Это не просто туфли. Это маска! Маскарадная! Вот попробуйте чуть затуманить взгляд и взглянуть иначе. А еще два куска чёрного гранита и в каждом косточка от персика.

Но это уже плоды фантазии зрителя! И даже если туфли, что поданы оригинально, необычно, да еще интригует ожерелье, без настойчивости привнесённое в образ.

Свет не самый простой, но Вы смогли удачно скомпоновать и тени и сам объект съемки. Формы выявлены отчётливо и чёрно-белая реализация тут лишь в плюс.

Ничего лишнего. Очень красиво!

Хотя. туфли можно было бы компоновать не симметрично, чуть иначе, одну положить на бок, или вовсе, показать вид ровно сверху.

Полезная статья: «Как я ставлю свет при съемке натюрмортов»
http://intpicture.com/kak-ya-stavlyu-svet-pri-semke-natyurmortov/

Вот несколько работ моей студентки Галины Солохиной.

http://img-fotki.yandex.ru/get/6738/6594303.5a/0_7e2d9_8af750cd_orig

http://img-fotki.yandex.ru/get/9835/6594303.52/0_70333_44f46751_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/5001/6594303.51/0_6f76e_2b49c577_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/9305/6594303.50/0_6f221_60af6411_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/9836/6594303.4f/0_6e844_479b961f_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/9507/6594303.4a/0_6b634_21bfc197_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/9256/6594303.49/0_6ad45_5b3fd2c_XL.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/5639/6594303.44/0_66398_60bffc97_XL.jpg.jpg

http://ic.pics.livejournal.com/gerra_/4664730/3460/3460_original.jpg

http://img-fotki.yandex.ru/get/5628/6594303.41/0_64582_9216477f_XL.jpg

Обратите внимание как освещены детали, фон, как выбран материал фона.
Обратите внимание на формат кадра и компоновку. На сюжетную составляющую.

Замечания и рекомендации

Если коснуться работы в черно-белом ключе, то надо отметить, что фотография не всегда была цветной, и обесцвечивание изображения это не просто прием в графическом редакторе.

Именно монохромными фотографические изображения были долгое время.

Можно отметить следующие исторические монохромные процессы:

Калотипия (1835) — способ получения негативного изображения на бумаге, пропитанной светочувствительным раствором, которое использовалось впоследствии для изготовления позитивных бумажных отпечатков.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9805/16480689.12/0_9e42f_9efa7115_XL.jpg

Дагерротипия (1839 — способ непосредственного получения при съемке позитивного изображения. В качестве фотоматериала использовали посеребрённую медную пластинку. Пластинку тщательно полируют, затем непосредственно перед съёмкой обрабатывают парами йода, в результате чего образуется тончайший слой светочувствительного йодистого серебра. Под действием света в этом слое возникает скрытое изображение, проявляемое парами ртути. Полученное изображение закрепляют раствором тиосульфата натрия.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9828/16480689.12/0_9e430_2f8eaaeb_XL.jpg

Цианотипия(1842) — старый способ монохромной фотографической печати, который давал отпечатки голубого оттенка. Изобретён этот способ был в 1842 году английским учёным и астрономом, сэром Джоном Гершелем. В ходе реакции получается голубая краска (ферроцианид железа), более известная как берлинская лазурь. Получается монохромное сине-белое изображение, которое проявляется в обычной воде.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9810/16480689.12/0_9e431_116fd796_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/9810/16480689.12/0_9e432_69e8e277_XL.jpg

Я некоторое время исследовал этот процесс и даже подготовил серии фотографий.
Одну из серий тонировал в черном чае и получил оттенки сепии. К примеру, одну из серий, с названием «Алфавит» можно посмотреть в этой анимации:

Амбротипия, Коллодионный процесс (1851) — фотографический процесс, изобретённый в середине 1850-х Фредериком Скоттом Арчером. Вариант коллодионного процесса. В результате этого процесса получается стеклянный негатив, который выглядит как позитив, когда накладывается на чёрный фон.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9799/16480689.12/0_9e433_ece094c5_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/9764/16480689.12/0_9e434_7c102778_XL.jpg

Тинтайп или Ферротипия (1860-е) — фотографический процесс, разработанный в США в XIX веке. Он заменил амбротипию к концу Гражданской Войны и стал самым распространенным фотографическим процессом вплоть до введения современных «пленочных» процессов. Ферротипия продолжала использоваться до середины 1950-х годов. Ферротипия является небольшим усовершенствованием амбротипии, где стеклянная пластина заменена на лист железа или олова, покрытый черной эмалью

http://img-fotki.yandex.ru/get/9799/16480689.12/0_9e436_602cd0f7_XXL.jpg

Бромойль (1907) (бромомасляный процесс) — дополнительная обработка позитива, отпечатанного на бромосеребряной фотобумаге. Заключается в одновременном отбеливании изображения и дублении желатины двухромовокислыми солями. Бромойль широко применялся в первой половине 20-го века. Для него были характерны мягкие изображения, похожие на живопись.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9795/16480689.12/0_9e437_99c05859_XXL.jpg

Желатино-серебряный процесс — у большинства людей черно-белая фотография ассоциируется, конечно, с желатино-серебряными отпечатками. Они представляют собой позитивные изображения, проявленные при помощи химикатов на фотографической бумаге, покрытой светочувствительной желатиновой эмульсией, содержащей галогениды серебра. Первые бумаги, покрытые такой эмульсией, стали выпускаться в 1870-х годах, продолжив линию желатино-серебряных негативов на стекле. За десятилетие нововведение завоевало популярность и осталось стандартным фотопроцессом до сих пор. Следует отметить, что наравне с бромосеребряными фотобумагами до недавнего времени производились и хлоросеребряные, которые очень ценились фотографами за мягкость оттенков. Главными преимуществами желатиносеребряных отпечатков перед альбуминными были простота работы с ними и относительная стабильность фотографического изображения.

http://img-fotki.yandex.ru/get/9648/16480689.12/0_9e438_cb278b60_XXL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/9648/16480689.12/0_9e439_a4aa25a8_XXL.jpg

И в настоящее время выпускаются черно-белые пленки, фотобумага и существуют сообщества любителей черно-белой фотографии.

«Нелюбовь» традиционной фотографии к цвету хорошо сформулировал известный классик фотографии Анри Картье-Брессон в 1952 г.: «Я опасаюсь, чтобы такой сложный элемент, как цвет, не пошел в ущерб жизненной правде и той простой выразительности, которую мы можем иногда запечатлеть в черно-белой фотографии. Чтобы создавать действительно цветные фотографии, надо иметь возможность управлять цветом и находить свободу высказываться на основе великих законов, сформулированных импрессионистами, и которые даже фотограф не может игнорировать («закон одновременных цветовых контрастов» — который позволяет предвидеть изменение цвета одного предмета в соседстве с другим, поскольку один предмет стремится передать свой цвет другому и т.д.). Воспроизведение на изобразительной плоскости цветовых соотношений, встречающихся в реальном пространстве, порождает множество довольно сложных проблем – некоторые цвета поглощают свет, другие его отражают, следовательно некоторые цвета дают эффект удаления, другие приближения. Необходима соответствующая коррекция цветовых отношений, так как цвета, в природе находящиеся в глубине пространства, требуют отличного от естественного размещения на изобразительной плоскости».

За счёт черно-белого изображения фотограф может снизить акценты цвета и лучше обострить внимание зрителя на формах.

Кроме того, часто черно-белое изображение более терпимо к засвеченным участкам.

В качестве примера, одна из моих работ:
http://img-fotki.yandex.ru/get/6706/16480689.f/0_8f7c3_78edd434_XL.jpg

Учитывая, что мы воспринимаем окружающий мир в потрясающих воображение красках, сложно абстрагироваться, чтобы при съемке получить качественные черно-белые фотографии. Для этого нужно научить себя представлять конечный результат и производить фотосъемку с черно-белым образом в собственном воображении. То есть, заранее важно представлять результат. Но это еще не значит, что цвет нужно отбросить.

Необходимо понимание, насколько повлияет та или иная тональность, что приобретет, а что потеряет снимок от обесцвечивания, насколько светлой или темной будет та или иная деталь в кадре. Ведь разный цвет даёт разные тональности.

Как пример, красная шляпка на зеленой траве в цвете смотрится контрастно и заметно выделяется, а вот в черно-белом изображении эти цвета могут выглядеть схожими, близкими, и утратится акцент в тональных переходах, из-за чего формы воспримутся плоско. Потому важно предполагать, как выбрать детали в таких тональностях, чтобы в черно-белом изображении они были контрастны.

Как пример, несколько моих работ:
http://img-fotki.yandex.ru/get/5636/16480689.e/0_8651b_ad14b1a9_XL.jpg — лодка явно доминирует цветом в кадре

http://img-fotki.yandex.ru/get/4130/16480689.e/0_864d5_26bb4da7_XL.jpg — формы стали более близки, картина утратила экспрессию

http://img-fotki.yandex.ru/get/4137/16480689.e/0_86431_a9b353eb_XL.jpg — как видим, цвет несколько разобщает картину.

http://img-fotki.yandex.ru/get/6432/16480689.e/0_86430_e659d612_XL.jpg — обесцвеченный вариант лучше воспринимается на формах, смотрится под стать погоде, более единообразно

Свет – важнейший инструмент в фотографии. Важно уточнить и то, что рисунок светотени выполняет одну из важнейших ролей в черно-белой фотографии. Свет помогает разделить детали, выявить формы, фактуру, объем, и направить взгляд зрителя именно к ярким участкам изображения, ведь подсознательно зритель обращает внимание именно на самые светлые участки в области кадра.

Потому важно избегать перенасыщения снимка серым цветом, и лучше работать на контрасте, когда в кадре есть и отчетливый черный и отчетливый белый. То есть, важно работать с контрастом. Сильного контраста можно легко добиться, фотографируя в солнечный день. Низкий контраст поджидает в туманах и снегопадах.

Часто случается так, что от зрителя в цвете ускользают формы и детали. А их очень существенно можно выявить именно за счёт черно-белого изображения. Отбрасывая цвет, фотограф усиливает внимание зрителя именно на форме. И тут важно подбирать такой сюжет, где формы преобладают, несут сюжетный оборот или образуют интересную текстуру.

Еще примеры моих черно-белых работ:
http://img-fotki.yandex.ru/get/4523/16480689.9/0_61f6e_8c11682f_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/5823/16480689.a/0_644c2_9e6ab4e5_XL.jpg

В пейзаже часто встречается множество оттенков, но бывает, что они как раз таки ощущаются лишними, и черно-белый вариант позволяет фотографу усилить в кадре влияние линий и тональностей. А также черно-белое изображение само по себе минималистично и идеально подходит для минимализма в кадре, где нет лишних деталей.

Еще несколько моих фото для примера:
http://img-fotki.yandex.ru/get/6000/pritisk.5/0_46292_5fd6a701_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/4800/pritisk.2/0_2d875_af26853f_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/4507/pritisk.3/0_359b9_b30064a1_XL.jpg

Через черно-белое изображение можно передать настроение. Например драматичность сцены с грозовыми облаками, или напротив, облегчить снимок, придав ощущение нереальности, лишая мир многообразия за счёт монотонных фактур тумана, дождя, снега, воды.

Как пример, еще пара моих фотографий в черно-белом исполнении:
http://img-fotki.yandex.ru/get/4307/pritisk.1/0_24897_fb93e7be_XL.jpg
http://img-fotki.yandex.ru/get/4314/pritisk.1/0_24886_7d0f54c5_XL.jpg

Если говорить о силуэтной съемке, то она фактически вся легко вписывается в монохром, ведь жанр силуэта как раз таки основан именно на формах, которые не так уж нуждаются в передаче объема.

Хочу предостеречь от распространённой ошибки, если есть возможность произвести снимок в цвете, то не фотографируйте сразу в в ЧБ, даже если Вам это может показаться хорошей идеей. Обесцветить кадр можно и после съемки, в графическом редакторе, но если снимок сразу произведен в монохроме, то вернуть цвет уже будет невозможно.

Выводы

У Вас получилась очень оригинальная работа. Поражает формами. Многослойным содержанием. Цветом.

Принимаю. Качественно и Красиво!

Влияет ли размер гранул на результаты лечения пациентов при химиоэмболизации с добавлением иринотекана гранулами плюс режимы системной химиотерапии для печеночно-доминантного колоректального рака? Результаты наблюдательного исследования

Цель: Мы исследовали клинические эффекты размера гранул при химиоэмболизации гранул с иринотеканом (DEBIRI), используемых для лечения колоректального рака с преобладанием печени.

Материалы и методы: В период с марта 2009 года по январь 2018 года все последовательные пациенты с метастазами колоректального рака в печени, направленные на DEBIRI в нашем специализированном центре, были включены в обсервационное исследование.В дополнение к системной терапии пациенты получали лечение исключительно с использованием 100 мг загруженных иринотеканом гранул DC диаметром 70-150 мкм (группа малых гранул или SB) или 100-300 мкм (группа больших гранул или LB). Оценивали степень ответа опухоли печени через 3 месяца, выживаемость печени и общую выживаемость без прогрессирования (ВБП) и общую выживаемость.

Полученные результаты: Всего 84 пациента с прогрессирующим заболеванием печени прошли 232 сеанса DEBIRI.Пятьдесят четыре пациента лечились в группе SB и 30 пациентов в группе LB. Частота отсутствия прогрессирования в печени через 3 месяца составила 86,7% для группы LB и 79,6% для группы SB (NS). Медиана ВБП печени и общая ВБП составляли, соответственно, 7,15 месяцев и 7,15 месяцев для группы LB и 7,65 и 7,55 месяцев для группы SB (NS). Медиана общей выживаемости составила 13,04 месяца для группы LB и 15,59 месяца для группы SB (p = 0,04). Частота токсичности специфической обработки 3 + 4 составила 5 (17%) в группе LB и 20 (37%) в группе SB.

Заключение: Между размерами шариков DEBIRI 70-150 мкм и 100-300 мкм не наблюдалось значительных различий в результатах лечения пациентов. Тенденция к более высокой специфической токсичности наблюдалась при использовании шариков меньшего размера.

Ключевые слова: Химиоэмболизация; Колоректальные метастазы в печени; Колоректальные новообразования; Новообразования печени / вторичные; Новообразования печени / терапия; Лечебные / методы.

Деревянные бусины Melissa & Doug разноцветные со шнурками № 544, плюс 25 винтажных бусин 772005449

Состояние:	Использовал : Предмет, который использовался ранее. См. Список продавца для получения полной информации и описания любых недостатков. Просмотреть все определения условий — открывается в новом окне или вкладке
Примечания продавца:	« Хорошее состояние из дома без дыма и домашних животных ”

JT-301 Athearn HO Flat Car Southern 51078 Детский набор музыкальных инструментов Jojoin, набор из 24 деревянных ударных инструментов для малыша Роберт Грэм SURFTOWN Футболка Skeleton Wave Small NWT FREE SHIP S & nbsp Le Metier De Beaute Édition Limitée Obsidienne Joueyssey Lip Калеидоскоп ADIDAS Adizero 10.0 Zubaz Purple LSU Мужские футбольные бутсы Sz 15 EF8596 Rtl 120 $ Подставка Quiklok от Orchestra ms320 & nbsp 7109850 Переходные кисти для малышей (24 шт.) 403750 УПЛОТНЕНИЕ ВРАЩАЮЩЕГОСЯ ВАЛА V-375A 13-1 / 4 «DIA VR1 R & nbsp Кольца для полотенец Хромированные настенные винты для крепления и всасывания Ванная комната Кухня & nbsp Vtg РЕДКИЕ 80-е Adidas Stan Smith Обувь Мужчины 8 Кожаный теннисный трилистник и nbsp Martin 5JN SLEEVE для муфты вала SURE-FLEX размера 5 & nbsp Tour S Issue Xr 16 Минусовой Недоступный верхний угол 8.ПОДШИПНИКИ ТОЛЬКО ГОЛОВКИ 5 градусов & nbsp КРЕПЕЖНЫЕ ПОДШИПНИКИ CB313732 Подшипник скольжения, внутр. 1-15 / 16, L 4 7178009 & nbsp Bandai SDW Heroes BB Senshi № 03 Sargent Verde Buster Gundam Набор пластиковых моделей! 4573102615503 Смесь для напитков CocoaVia Heart and Brain с оригинальным вкусом 450 мг флаванолов какао … 850487002604 Комплект British Army Chieftain Mk.5 Tamiya — полный, запечатанные пакеты — бесплатная доставка Amazon Echo Dot (3-го поколения) Smart Alexa Speaker — уголь Новый and Sealed & nbsp Vintage Refrigi Wear Youth или женский лыжный зимний комбинезон Темно-синий утепленный с капюшоном

Разноцветные деревянные бусины Melissa & Doug со шнурками № 544, плюс 25 винтажных бусин 772005449

Разноцветные деревянные бусины Melissa & Doug со шнурками № 544, плюс 25 винтажных бусин 772005449

Игрушки и хобби

Набор IP для ферментативного хроматина SimpleChIP® Plus (гранулы агарозы)

Хроматин IP

Специально для продукта: SimpleChIP ^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) # 9004.

Необходимые реагенты

Включено реагентов:

1. Раствор глицина (10X) # 7005
2. Буфер A (4X) # 7006
3. Буфер B (4X) # 7007
4. Чип-буфер (10X) # 7008
5. ChIP Elution Buffer (2X) # 7009
6. 5 M NaCl # 7010
7. 0,5 М ЭДТА # 7011
8. ChIP-Grade Protein G Agarose Beads (блокированные BSA и обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося) # 9007
9. Буфер для связывания ДНК №10007
10. Буфер для промывки ДНК (перед использованием добавьте 4-кратный объем этанола) # 10008
11. Буфер для элюции ДНК №10009
12. Спиновые колонки и пробирки для ДНК # 10010
13. Коктейль с ингибиторами протеазы (200X) # 7012
14. РНКаза A (10 мг / мл) # 7013
15. Нуклеаза микрококка №10011
16. Протеиназа К (20 мг / мл) # 10012
17. SimpleChIP ^® Праймеры экзона 3 RPL30 человека 1 # 7014
18. SimpleChIP ^® Mouse RPL30 Intron 2 Праймеры 1 # 7015
19. Гистон h4 (D2B12) XP ^® Кроличьи mAb (в составе ChIP) # 4620
20. Нормальный IgG кролика # 2729
21. DTT (дитиотреитол) # 7016

Реагенты, не включенные:

1. 1X PBS № 9872
2. Вода, свободная от нуклеаз # 12931
3. Этанол (96-100%)
4. Формальдегид (37% акций)
5. SimpleChIP ^® Универсальный мастер-микс для qPCR # 88989

!	Это! означает важный шаг в протоколе, касающийся изменения объема в зависимости от количества препаратов иммунопреципитации (IP preps).Один препарат IP определяется как 4 x 10 6 культивируемых клеток ткани или 25 мг или дезагрегированной ткани.
!!	Это !! означает важный шаг по разбавлению буфера перед продолжением.
БЕЗОПАСНЫЙ ОСТАНОВ	Это безопасная точка остановки в протоколе, если остановка необходима.

I. Сшивание тканей и подготовка образцов

При заборе ткани удалите из образца нежелательный материал, такой как жир и некротический материал.Затем ткань можно обработать и сразу же сшить или заморозить на сухом льду и хранить при -80 ° C для дальнейшей обработки. Для оптимального выхода хроматина и результатов ChIP используйте 25 мг ткани для каждой иммунопреципитации. Выход хроматина действительно варьируется в зависимости от типа ткани, и для некоторых тканей может потребоваться более 25 мг для каждой иммунопреципитации. См. Приложение A для получения дополнительной информации об ожидаемом выходе хроматина для различных типов тканей. Один дополнительный образец хроматина должен быть обработан для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV).При желании следует обработать пять дополнительных образцов хроматина для оптимизации расщепления хроматина (Приложение B).

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.

• Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль с ингибитором протеазы (PIC) № 7012 и 10-кратный раствор глицина № 7005. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
• Приготовьте 3 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) + 15 мкл 200X PIC на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и поместите на лед.
• Приготовьте 45 мкл 37% формальдегида на 25 мг ткани, подлежащей обработке, и храните при комнатной температуре. Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.

A. Сшивка

1. Взвесьте образец свежей или замороженной ткани. Используйте 25 мг ткани для каждого выполняемого IP (для одного эксперимента требуется не менее 75 мг ткани, чтобы включить положительный и отрицательный контроли).
2. Поместите образец ткани в чашку диаметром 60 или 100 мм и мелко измельчите чистым скальпелем или бритвой.Держите блюдо на льду. Важно держать ткани в холоде, чтобы избежать деградации белков.
3. Перенести измельченную ткань в коническую пробирку на 15 мл.
4. Добавьте 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани в коническую пробирку.
5. Чтобы связать белки с ДНК, добавьте 45 мкл 37% формальдегида на 1 мл PBS + PIC и встряхните при комнатной температуре в течение 20 мин. Конечная концентрация формальдегида составляет 1,5%.
6. Остановите перекрестное связывание, добавив 100 мкл 10X глицина на 1 мл PBS + PIC, и перемешайте в течение 5 минут при комнатной температуре.
7. Центрифугируйте ткань при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
8. Удалите супернатант и промойте один раз 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани.
9. Повторите центрифугирование при 500 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
10. Удалите супернатант и ресуспендируйте ткань в 1 мл PBS + PIC на 25 мг ткани и храните на льду. Разбейте ткань на суспензию отдельных клеток, используя Medimachine (Часть B) или гомогенизатор Даунса (Часть C). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C перед дезагрегацией до 3 месяцев.

B. Дезагрегация тканей с использованием Medimachine от BD Biosciences (номер детали 340587)

1. Отрежьте конец наконечника пипетки на 1000 мкл, чтобы увеличить отверстие для переноса кусочков ткани.
2. Перенесите 1 мл ткани, ресуспендированной в PBS + PIC, в верхнюю камеру 50 мм medicone (деталь № 340592).
3. Растереть ткань в течение 2 мин в соответствии с инструкциями производителя.
4. Соберите клеточную суспензию из нижней камеры медикона с помощью шприца на 1 мл и тупой иглы 18 калибра.Перенести клеточную суспензию в коническую пробирку на 15 мл и поместить на лед.
5. Повторяйте шаги 2–4, пока вся ткань не превратится в гомогенную суспензию.
6. Если необходимо дополнительное измельчение, добавьте в ткань еще PBS + PIC. Повторяйте шаги со 2 по 5, пока вся ткань не будет измельчена до однородной суспензии.
7. Проверьте суспензию отдельных клеток под микроскопом (необязательно).
8. Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
9. Удалить супернатант из клеток и продолжить подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).

C. Дезагрегация тканей с использованием гомогенизатора Dounce

1. Перенесите ткань, ресуспендированную в PBS + PIC, в гомогенизатор Даунса.
2. Разбейте кусочки ткани 20-25 движениями. Проверьте суспензию отдельных клеток под микроскопом (необязательно).
3. Перенесите суспензию клеток в коническую пробирку на 15 мл и центрифугируйте при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C.
4. Удалить супернатант из клеток и продолжить подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).

II. Сшивание клеточной культуры и подготовка образца:

Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно 4 X 10 ⁶ клеток для каждой иммунопреципитации (требуется не менее 12 X 10 ⁶ клеток, чтобы включить положительный и отрицательный контроли). Для клеток HeLa один IP эквивалентен половине 15-см культуральной чашки, содержащей 90% конфлюэнтных клеток в 20 мл питательной среды. Один дополнительный образец должен быть обработан для анализа расщепления и концентрации хроматина (Раздел IV).Поскольку каждый тип клеток отличается, мы рекомендуем включить в эксперимент одну дополнительную чашку с клетками, которая будет использоваться для определения количества клеток с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству используемых чашек для культивирования тканей диаметром 15 см (или 20 мл суспензионных клеток).

• Удалите и нагрейте 200-кратный коктейль с ингибитором протеазы (PIC) № 7012 и 10-кратный раствор глицина № 7005. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
• Приготовьте 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 10 мкл 200X PIC на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
• Приготовьте 40 мл PBS на 15 см чашку (или 20 мл суспензии клеток) для обработки и поместите на лед.
• Приготовьте 540 мкл 37% формальдегида на 15-сантиметровую чашку (или 20 мл суспензии клеток) клеток для обработки и храните при комнатной температуре. Используйте свежий формальдегид, срок годности которого не истек.

1. Для сшивания белков с ДНК добавьте 540 мкл 37% формальдегида в каждую 15-сантиметровую культуральную чашку, содержащую 20 мл среды.Для суспензионных клеток добавьте 540 мкл 37% формальдегида к клеткам, суспендированным в 20 мл среды (для оптимальной фиксации суспензионных клеток плотность клеток должна быть менее 0,5 x 10 ⁶ клеток / мл при фиксации). Коротко встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация формальдегида составляет 1%. Добавление формальдегида может привести к изменению цвета среды.
2. Добавьте 2 мл 10-кратного глицина в каждую 15-сантиметровую чашку, содержащую 20 мл среды, быстро встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.Добавление глицина может привести к изменению цвета среды.
3. Для суспензионных клеток перенесите клетки в коническую пробирку на 50 мл, центрифугируйте при 500 x g в настольной центрифуге 5 мин при 4 ° C и дважды промойте осадок 20 мл ледяного PBS. Удалите супернатант и немедленно продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (Раздел III).
4. Для прикрепившихся клеток удалите среду и дважды промойте клетки 20 мл ледяного 1X PBS, каждый раз полностью удаляя смыв из чашки для культивирования.
5. Добавьте 2 мл ледяного PBS + PIC в каждую 15-сантиметровую чашку. Соскоблите клетки в холодный буфер. Объедините клетки из всех чашек для культивирования в одну коническую пробирку на 15 мл.
6. Центрифугируйте клетки при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и продолжите подготовку ядер и расщепление хроматина (раздел III). (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -80 ° C до 3 месяцев.

III. Подготовка ядер и расщепление хроматина

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера должны быть увеличены пропорционально количеству подготовленных IP в эксперименте.

1. Ресуспендировать клетки в 1 мл ледяного 1X буфера A + DTT + PIC на IP преп. Инкубируйте на льду 10 мин. Перемешивайте, переворачивая пробирку каждые 3 мин.
2. Ядра гранул центрифугированием при 2000 x g в настольной центрифуге в течение 5 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл ледяного 1X буфера B + DTT на IP преп. Повторите центрифугирование, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 мкл 1X буфера B + DTT на IP преп. Перенесите образец в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, всего до 1 мл на пробирку.
3. Добавить 0,5 мкл микрококковой нуклеазы № 10011 на препарат IP, перемешать, перевернув пробирку несколько раз, и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C с частым перемешиванием для расщепления ДНК до длины приблизительно 150-900 п.н. Перемешивать переворачиванием каждые 3-5 мин. Количество микрококковой нуклеазы, необходимое для переваривания ДНК до оптимальной длины, может потребоваться эмпирически для определения отдельных тканей и клеточных линий (см. Приложение B). Ядра HeLa, переваренные 0,5 мкл микрококковой нуклеазы на 4 × 10 ⁶ клеток, и ткань печени мыши, переваренная 0.5 мкл микрококковой нуклеазы на 25 мг ткани давали фрагменты ДНК соответствующей длины.
4. Остановите переваривание, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА # 7011 на препарат IP и поместив пробирку на лед на 1-2 мин.
5. Ядра гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
6. Ресуспендируйте ядерный осадок в 100 мкл 1X ChIP Buffer + PIC на каждый IP-препарат и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
7. Обработка ультразвуком до 500 мкл лизата на 1,5 мл микроцентрифужную пробирку с несколькими импульсами для разрушения ядерной мембраны.Инкубируйте образцы в течение 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 серий 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100 при настройке 6 с зондом 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
8. Осветить лизаты центрифугированием при 9400 x g в микроцентрифуге в течение 10 минут при 4 ° C.
9. Перенести супернатант в новую пробирку. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) Это препарат сшитого хроматина, который следует хранить при -80 ° C до дальнейшего использования. Удалите 50 мкл препарата хроматина для анализа переваривания и концентрации хроматина (раздел IV). Этот образец объемом 50 мкл можно хранить при -20 ° C в течение ночи.

IV. Анализ расщепления и концентрации хроматина (рекомендуемый этап)

1. К 50 мкл образца хроматина (из этапа 9 в разделе III) добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 M NaCl № 7010 и 2 мкл РНКазы A № 7013.Вортекс для смешивания и инкубирования образцов при 37 ° C в течение 30 мин.
2. К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K # 10012. Перемешайте и инкубируйте образцы на вортексе при 65 ° C в течение 2 часов.
3. Очистите ДНК из образцов, используя спин-колонки для очистки ДНК, как описано в разделе VII. (БЕЗОПАСНЫЙ СТОП) ДНК можно хранить при -20 ° C до 6 месяцев.
4. После очистки ДНК удалите образец объемом 10 мкл и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза на 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.ДНК должна быть переварена до длины примерно 150-900 п.н. (от 1 до 5 нуклеосом).
5. Чтобы определить концентрацию ДНК, перенесите 2 мкл очищенной ДНК в 98 мкл воды, свободной от нуклеаз, чтобы получить 50-кратное разведение, и прочитайте OD260. Концентрация ДНК в мкг / мл составляет OD ₂₆₀ x 2500. В идеале концентрация ДНК должна составлять от 50 до 200 мкг / мл.

ПРИМЕЧАНИЕ : Для получения оптимальных результатов ЧИП крайне важно, чтобы хроматин имел соответствующий размер и концентрацию.Избыточное переваривание хроматина может уменьшить сигнал при количественной оценке ПЦР. Недостаточное переваривание хроматина может привести к усилению фонового сигнала и снижению разрешения. Добавление слишком малого количества хроматина к IP может привести к снижению сигнала при количественной оценке ПЦР. Протокол оптимизации переваривания хроматина можно найти в Приложении B.

V. Иммунопреципитация хроматина

Для получения оптимальных результатов ChIP используйте приблизительно от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина (как определено в разделе IV) на иммунопреципитацию.Это должно быть примерно эквивалентно одной 100 мкл IP-препарата из 25 мг дезагрегированной ткани или 4 x 10 ⁶ клеток культуры ткани. Обычно 100 мкл расщепленного хроматина разводят в 400 мкл 1X ChIP Buffer перед добавлением антител. Однако, если на IP требуется более 100 мкл хроматина, препарат сшитого хроматина не нужно разбавлять, как описано ниже. Антитела можно добавлять непосредственно в неразбавленный препарат хроматина для иммунопреципитации хроматиновых комплексов.

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитаций в эксперименте.

• Удалите и нагрейте коктейль с 200-кратным ингибитором протеазы (PIC) # 7012. Убедитесь, что PIC полностью разморожен.
• Удалите и нагрейте 10X ChIP Buffer # 7008 и убедитесь, что SDS полностью находится в растворе.
• Оттаять расщепленный препарат хроматина (из шага 9 в разделе III) и поместить на лед.
• Приготовьте промывку с низким содержанием соли: 3 мл 1X ChIP Buffer (300 мкл 10X ChIP Buffer # 7008 + 2.7 мл воды) на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.
• Приготовьте промывку с высоким содержанием соли: 1 мл 1X буфера ChIP (100 мкл 10X буфера ChIP # 7008 + 900 мкл воды) + 70 мкл 5M NaCl # 7010 на иммунопреципитацию. Хранить при комнатной температуре до использования.

1. В одной пробирке приготовьте достаточно 1X буфера ChIP для разведения расщепленного хроматина до желаемого количества иммунопреципитации: 400 мкл буфера 1X ChIP (40 мкл буфера 10X ChIP + 360 мкл воды) + 2 мкл 200X PIC на иммунопреципитацию .При определении количества иммунопреципитации не забудьте включить образцы положительного контроля гистона h4 (D2B12) XP ^® мАт кролика № 4620 и отрицательного контроля нормального кроличьего IgG антитела № 2729. Выложите смесь на лед.
2. К приготовленному буферу 1X ChIP добавьте эквивалент 100 мкл (от 5 до 10 мкг хроматина) расщепленного препарата сшитого хроматина (из этапа 9 в разделе III) на иммунопреципитацию. Например, для 10 иммунопреципитации подготовьте пробирку, содержащую 4 мл 1X ChIP Buffer (400 мкл 10X ChIP Buffer + 3.6 мл воды) + 20 мкл 200X PIC + 1 мл препарата расщепленного хроматина.
3. Удалите 10 мкл образца разбавленного хроматина и перенесите в пробирку для микроцентрифугирования. Это ваш 2% входной образец, который можно хранить при -20 ° C до дальнейшего использования (шаг 1 в разделе VI).
4. Для каждой иммунопреципитации перенесите 500 мкл разбавленного хроматина в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и добавьте иммунопреципитирующие антитела. Количество антител, необходимое для одного IP, варьируется и должно определяться пользователем.Для положительного контроля: гистон h4 (D2B12) XP ^® Rabbit mAb # 4620, добавьте 10 мкл к образцу IP. Для отрицательного контроля Нормальный кроличий IgG # 2729 добавьте 1 мкл (1 мкг) к 2 мкл (2 мкг) к образцу IP. При использовании антител от Cell Signaling Technology см. Рекомендуемые разведения, указанные в техническом описании или на веб-странице продукта, и рассчитайте количество (мкг) антител IgG для отрицательного контроля на основе концентрации сигнальных антител для сравнения. Инкубируйте образцы IP от 4 ч до ночи при 4 ° C с вращением.

   ПРИМЕЧАНИЕ : Большинство антител от Cell Signaling Technology оптимально работают между 1 и 2 мкг на образец IP. В случае, когда имеется несколько образцов с различными концентрациями, лучше всего сопоставить отрицательный контроль Нормальный IgG кролика # 2729 с наивысшей концентрацией антител.

5. Ресуспендировать ChIP-Grade Protein G Agarose Beads # 9007 осторожным встряхиванием. Немедленно добавьте 30 мкл агарозных гранул ChIP-Grade Protein G Agarose в каждую IP-реакцию и инкубируйте в течение 2 ч при 4 ° C с вращением.

ПРИМЕЧАНИЕ : Гранулы агарозы с протеином G ChIP-Grade заблокированы обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося и несовместимы с ChIP-Seq.

6. Гранулы агарозы с белком G в каждой иммунопреципитации путем кратковременного центрифугирования в течение 1 мин при 3400 x g в микроцентрифуге и удаления супернатанта.
7. Промойте гранулы агарозы с белком G для ChIP-Grade, добавив к гранулам 1 мл промывного раствора с низким содержанием соли, и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении. Повторите шаги 6 и 7 еще два раза, всего 3 промывки с низким содержанием соли.
8. Добавьте к шарикам 1 мл промывного раствора с высоким содержанием соли и инкубируйте при 4 ° C в течение 5 минут при вращении.
9. Гранулы агарозы с белком G в каждой иммунопреципитации путем кратковременного центрифугирования в течение 1 мин при 3400 x g в микроцентрифуге и удаления супернатанта. Сразу переходите к разделу VI.

VI. Элюция хроматина из гранул агарозы антитело / белок G и изменение поперечных сшивок

Перед запуском:

(!) Все объемы буфера следует увеличивать пропорционально количеству иммунопреципитаций в эксперименте.

• Удалите и нагрейте 2X ChIP Elution Buffer # 7009 на водяной бане с 37 ° C и убедитесь, что SDS находится в растворе.
• Установите водяную баню или термомиксер на 65 ° C.
• Приготовьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP (75 мкл буфера для элюции 2X ChIP № 7009 + 75 мкл воды) для каждой иммунопреципитации и 2% входного образца.

1. Добавьте 150 мкл буфера для элюирования 1X ChIP в пробирку с образцом для ввода 2% и отставьте при комнатной температуре до этапа 6.
2. Добавьте 150 мкл буфера для элюции 1X ChIP в каждый образец IP.
3. Элюируйте хроматин из гранул агарозы антитело / белок G в течение 30 мин при 65 ° C с осторожным встряхиванием (1200 об / мин). На этом этапе лучше всего подходит термомиксер. В качестве альтернативы элюирование можно проводить при комнатной температуре с вращением, но оно может быть не таким полным.
4. Гранулы агарозы с белком G в каждой иммунопреципитации путем кратковременного центрифугирования в течение 1 мин при 3400 x g в микроцентрифуге и удаления супернатанта.
5. Осторожно перенесите элюированный супернатант хроматина в новую пробирку.
6. Во все пробирки, включая 2% входной образец с шага 1, обратное сшивание путем добавления 6 мкл 5M NaCl и 2 мкл протеиназы K # 10012 и инкубирование 2 часа при 65 ° C. Инкубацию можно продлить на ночь.
7. Сразу переходите к Разделу VII. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) В качестве альтернативы образцы можно хранить при -20 ° C до 4 дней. Однако, чтобы избежать образования осадка, не забудьте нагреть образцы до комнатной температуры перед добавлением ДНК-связывающего буфера №10007 (раздел VII, шаг 1).

VII.Очистка ДНК с использованием спиновых колонок:

Перед запуском:

• (!!) Добавьте 24 мл этанола (96-100%) в буфер для промывки ДНК №10008 перед использованием. Этот шаг необходимо выполнить только один раз перед первым набором очистки ДНК.
• Удалите по одной пробирке для сбора ДНК для очистки # 10010 для каждого образца ДНК из секции V.

1. Добавьте 750 мкл буфера для связывания ДНК №10007 в каждый образец ДНК и быстро встряхните.
   • На каждый 1 объем образца следует использовать 5 объемов буфера для связывания ДНК.
2. Перенесите 450 мкл каждого образца из этапа 1 на спин-колонку ДНК в пробирке для сбора.
3. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
4. Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
5. Перенесите оставшиеся 450 мкл каждого образца из этапа 1 в спин-колонку в пробирке для сбора. Повторите шаги 3 и 4.
6. Добавьте 750 мкл буфера для промывки ДНК №10008 в спин-колонку в пробирке для сбора.
7. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
8. Снимите спин-колонку с пробирки для сбора и слейте жидкость. Замените спин-колонку в сборной трубке.
9. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд.
10. Удалить пробирку для сбора и жидкость. Сохраните спин-колонку.
11. Добавьте 50 мкл буфера для элюции ДНК № 10009 в каждую спин-колонку и поместите в чистую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл.
12. Центрифуга при 18 500 x g в микроцентрифуге в течение 30 секунд для элюирования ДНК.
13. Удалите и утилизируйте спин-колонку с ДНК. Элюат теперь представляет собой очищенную ДНК. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) Образцы можно хранить при -20 ° C.

VIII. Количественное определение ДНК с помощью ПЦР:

Рекомендации:

• Используйте наконечники для пипеток с фильтром, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
• Контрольные праймеры, включенные в набор, специфичны для гена RPL30 человека или мыши (№7014 + №7015) и могут использоваться либо для стандартной ПЦР, либо для количественной ПЦР в реальном времени. Если пользователь выполняет ChIPs от другого вида, рекомендуется, чтобы пользователь разработал соответствующие специфические праймеры для ДНК и определил оптимальные условия ПЦР.
• Рекомендуется использовать Taq-полимеразу Hot-Start для минимизации риска неспецифических продуктов ПЦР.
Выбор праймера для ПЦР
• имеет решающее значение. Грунтовки должны разрабатываться с точным соблюдением следующих критериев:

Длина праймера:	24 нуклеотида
Оптимальная температура пл .:	60 ° C
Оптимальный ГХ:	50%
Размер ампликона:	От 150 до 200 п.н. (для стандартной ПЦР)
	от 80 до 160 п.н. (для количественной ПЦР в реальном времени)

Стандартный метод ПЦР:

1. Обозначьте соответствующее число 0.2 мл пробирки для ПЦР для количества анализируемых образцов. Сюда должны входить 2% входной образец, положительный контрольный образец гистона h4, отрицательный контрольный образец нормального кроличьего IgG и пробирка без ДНК для контроля загрязнения ДНК.
2. Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку.
3. Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже, убедившись, что добавлено достаточно реагента для двух дополнительных пробирок, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл мастер-микса в каждую реакционную пробирку.

Реагент	Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл)
Без нуклеаз H 2 O	12,5 мкл
10X Буфер для ПЦР	2,0 мкл
4 мМ dNTP Mix	1,0 мкл
5 мкМ RPL30 Праймеры	2,0 мкл
ДНК-полимераза Taq	0,5 мкл

4. Запустить следующую программу реакции ПЦР

а.	Начальная денатурация	95 ° C	5 мин
б.	Денатура	95 ° C	30 сек
г.	Отжиг	62 ° C	30 сек
г.	Удлинитель	72 ° C	30 сек
д.	Повторите шаги b-d всего 34 цикла.
ф.	Окончательное удлинение	72 ° C	5 мин

5. Удалите 10 мкл каждого продукта ПЦР для анализа с помощью электрофореза в 2% агарозном геле или 10% полиакриламидном геле с маркером ДНК 100 п.н.Ожидаемый размер продукта ПЦР составляет 161 п.н. для RPL30 # 7014 человека и 159 п.н. для RPL30 # 7015 мыши.

Количественный метод ПЦР в реальном времени:

1. Пометьте соответствующее количество пробирок для ПЦР или планшетов для ПЦР, совместимых с моделью используемого ПЦР-аппарата. Реакции ПЦР должны включать образец гистона h4 положительного контроля, образец нормального кроличьего IgG отрицательного контроля, пробирку без ДНК для контроля контаминации и серийное разведение 2% входящей ДНК хроматина (неразбавленной, 1: 5, 1:25 , 1: 125), чтобы построить стандартную кривую и определить эффективность усиления.
2. Добавьте 2 мкл соответствующего образца ДНК в каждую пробирку или лунку планшета для ПЦР.
3. Приготовьте основную реакционную смесь, как описано ниже. Добавьте достаточно реагентов для двух дополнительных реакций, чтобы учесть потерю объема. Добавьте 18 мкл реакционной смеси в каждую реакционную пробирку или лунку для ПЦР. (БЕЗОПАСНАЯ ОСТАНОВКА) При необходимости накройте пластину алюминиевой фольгой во избежание попадания света и храните при 4 ° C до 4 часов или -20 ° C в течение ночи, пока машина не будет готова к использованию.

Реагент	Объем для 1 реакции ПЦР (18 мкл)
Без нуклеаз H 2 O	6 мкл
5 мкМ RPL30 Праймеры	2 мкл
SimpleChIP ® Universal qPCR Master Mix # 88989	10 мкл

4. Запустите следующую программу реакции ПЦР:

а.	Начальная денатурация	95 ° C 3 мин
б.	Денатура	95 ° C 15 сек
г.	Отжиг и удлинение:	60 ° C 60 сек
г.	Повторите шаги b и c всего 40 циклов.

5. Проанализируйте количественные результаты ПЦР с помощью программного обеспечения, поставляемого с машиной для ПЦР в реальном времени. В качестве альтернативы можно рассчитать эффективность IP вручную, используя метод процентного ввода и уравнение, показанное ниже.С помощью этого метода сигналы, полученные от каждой иммунопреципитации, выражаются в процентах от общего входящего хроматина.

Процент ввода = 2% x 2 ^{(C [T] 2% входной выборки — C [T] IP выборки)}

C [T] = C _T = Пороговый цикл реакции ПЦР

ПРИЛОЖЕНИЕ A: Ожидаемый выход хроматина

При сборе сшитого хроматина из образцов ткани выход хроматина может значительно различаться между типами тканей. В таблице справа представлен диапазон ожидаемого выхода хроматина из 25 мг ткани по сравнению с 4 x 10 ⁶ клеток HeLa, а также ожидаемая концентрация ДНК, как определено в разделе IV протокола.Для каждого типа ткани дезагрегация с использованием Medimachine (BD Biosciences) или гомогенизатора Даунса давала аналогичные количества хроматина. Однако хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием Medimachine, обычно давал более высокую IP-эффективность, чем хроматин, обработанный из тканей, дезагрегированных с использованием гомогенизатора Даунса. Гомогенизатор Даунса настоятельно рекомендуется для дезагрегации мозговой ткани, поскольку Medimachine не может адекватно дезагрегировать мозговую ткань в одноклеточную суспензию.Для получения оптимальных результатов ChIP мы рекомендуем использовать от 5 до 10 мкг расщепленного сшитого хроматина на одну иммунопреципитацию; поэтому для некоторых тканей может потребоваться сбор более 25 мг на каждую иммунопреципитацию.

Ткань / клетка	Общий выход хроматина	Ожидаемая концентрация ДНК
Селезенка	20-30 мкг на 25 мг ткани	200-300 мкг / мл
Печень	10-15 мкг на 25 мг ткани	100-150 мкг / мл
Почки	8-10 мкг на 25 мг ткани	80-100 мкг / мл
Мозг	2-5 мкг на 25 мг ткани	20-50 мкг / мл
Сердце	2-5 мкг на 25 мг ткани	20-50 мкг / мл
HeLa	10-15 мкг на 4 x 10 6 клеток	100-150 мкг / мл

ПРИЛОЖЕНИЕ B: Оптимизация расщепления хроматина

Оптимальные условия для переваривания сшитой ДНК хроматина до 150-900 пар оснований в значительной степени зависят от отношения микрококковой нуклеазы к количеству ткани или количеству клеток, используемых для переваривания.Ниже приведен протокол определения оптимальных условий пищеварения для конкретной ткани или типа клеток.

1. Приготовьте сшитые ядра из 125 мг ткани или 2 X 10 ⁷ клеток (эквивалент 5 препаратов IP), как описано в разделах I, II и III. Остановитесь после шага 2 раздела III и действуйте, как описано ниже.
2. Перенесите 100 мкл препарата ядер в 5 отдельных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и поместите на лед.
3. Добавьте 3 мкл исходного раствора микрококковой нуклеазы к 27 мкл 1X буфера B + DTT (разведение фермента 1:10).
4. В каждую из 5 пробирок на этапе 2 добавьте 0 мкл, 2,5 мкл, 5 мкл, 7,5 мкл или 10 мкл разведенной нуклеазы микрококка, перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C с частым перемешиванием. смешивание.
5. Остановите каждый процесс переваривания, добавив 10 мкл 0,5 М ЭДТА и поместив пробирки на лед.
6. Ядра гранул центрифугированием при 16000 x g в микроцентрифуге в течение 1 мин при 4 ° C и удалением супернатанта.
7. Ресуспендировать ядерный осадок в 200 мкл 1X ChIP Buffer + PIC.Инкубируйте на льду 10 мин.
8. Обработка лизата ультразвуком с помощью нескольких импульсов для разрушения ядерной мембраны. Инкубируйте образцы 30 секунд на влажном льду между импульсами. Оптимальные условия, необходимые для полного лизиса ядер, можно определить, наблюдая ядра под световым микроскопом до и после обработки ультразвуком. Ядра HeLa были полностью лизированы после 3 серий 20-секундных импульсов с использованием ультразвукового гомогенизатора / соникатора VirTis Virsonic 100, установленного на настройку 6 с помощью зонда 1/8 дюйма. Альтернативно ядра можно лизировать путем 20-кратной гомогенизации лизата в гомогенизаторе Даунса; однако лизис может быть не таким полным.
9. Осветить лизаты центрифугированием при 9,4000 x g в микроцентрифуге в течение 10 мин при 4 ° C.
10. Перенесите по 50 мкл каждого лизата, обработанного ультразвуком, в новые микроцентрифужные пробирки.
11. К каждому 50 мкл образца добавьте 100 мкл воды, свободной от нуклеаз, 6 мкл 5 M NaCl и 2 мкл РНКазы A. Вихревым движением перемешайте и инкубируйте образцы при 37 ° C в течение 30 мин.
12. К каждому образцу, расщепленному РНКазой A, добавьте 2 мкл протеиназы K. Вортекс перемешайте и инкубируйте образец при 65 ° C в течение 2 часов.
13. Удалите 20 мкл каждого образца и определите размер фрагмента ДНК с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с маркером ДНК 100 п.н.
14. Обратите внимание, при каких условиях переваривания получается ДНК в желаемом диапазоне от 150 до 900 пар оснований (от 1 до 5 нуклеосом). Объем разбавленной микрококковой нуклеазы, который дает желаемый размер фрагментов ДНК с использованием этого протокола оптимизации, эквивалентен 10-кратному объему исходного раствора микрококковой нуклеазы, который должен быть добавлен к одному препарату для иммунопреципитации (25 мг дезагрегированных тканевых клеток или 4 × 10 ⁶ клеток культуры ткани) для получения фрагментов ДНК желаемого размера.Например, если 5 мкл разведенной микрококковой нуклеазы дает фрагменты ДНК из 150-900 пар оснований в этом протоколе, то 0,5 мкл исходной микрококковой нуклеазы следует добавить к одному препарату IP во время переваривания хроматина в разделе III.
15. Если результаты показывают, что размер ДНК не соответствует желаемому диапазону, повторите протокол оптимизации, соответствующим образом регулируя количество микрококковой нуклеазы в каждом гидролизате. В качестве альтернативы время переваривания можно изменить, чтобы увеличить или уменьшить степень фрагментации ДНК.

ПРИЛОЖЕНИЕ C: Руководство по поиску и устранению неисправностей

Проблема	Возможные причины	Рекомендация
1. Слишком низкая концентрация расщепленного хроматина.	Для переваривания хроматина добавлено недостаточно клеток или ядра не были полностью лизированы после переваривания.	Если концентрация ДНК в препарате хроматина близка к 50 мкг / мл, добавьте дополнительный хроматин к каждому IP, чтобы получить не менее 5 мкг / IP, и продолжайте выполнение протокола. Подсчитайте клетки на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток и / или визуализировать ядра под микроскопом до и после обработки ультразвуком, чтобы подтвердить полный лизис ядер.
2. Хроматин недостаточно переварен, а фрагменты слишком большие (более 900 п.н.).	Возможно, клетки были чрезмерно сшиты. Перекрестное сшивание более 10 мин может ингибировать переваривание хроматина. Для расщепления хроматина было добавлено слишком много клеток или недостаточно микрококковой нуклеазы.	Выполните временной курс при фиксированной концентрации формальдегида. Сократите время сшивания до 10 минут или меньше. Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина.
3. Хроматин переваривается, и фрагменты слишком малы (только мононуклеосомы длиной 150 п.н.). Полное расщепление хроматина до мононуклеосомной ДНК может уменьшить сигнал во время количественной оценки ПЦР, особенно для ампликонов длиной более 150 п.н.	Для переваривания хроматина добавлено недостаточно клеток или слишком много микрококковой нуклеазы.	Подсчитайте количество клеток на отдельной пластине перед перекрестным связыванием, чтобы определить точное количество клеток, и см. Приложение B для оптимизации расщепления хроматина.
4. Нет продукта или очень мало продукта во входных реакциях ПЦР.	В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК или условия не оптимальны. ПЦР-амплифицированная область может охватывать область, свободную от нуклеосом. К IP добавлено недостаточно хроматина или хроматин переваривается.	Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации. Оптимизируйте условия ПЦР для экспериментального набора праймеров, используя очищенную ДНК из сшитого и расщепленного хроматина. Создайте другой набор праймеров и уменьшите длину ампликона до менее 150 п.н. (см. Рекомендации по созданию праймеров в разделе VIII). Для оптимальных результатов ChIP добавьте 5-10 мкг хроматина на IP.См. Рекомендации по проблемам 1 и 3 выше.
5. Нет продукта в положительном контроле. ПЦР-реакция гистона h4-IP RPL30.	В реакцию IP добавлено недостаточно хроматина или антител или время инкубации IP слишком короткое. Неполное элюирование хроматина с гранул белка G.	Обязательно добавьте 5-10 мкг хроматина и 10 мкл антитела в каждую реакцию IP и инкубируйте с антителом в течение ночи и еще 2 часа после добавления шариков с протеином G. Элюция хроматина из шариков с протеином G оптимальна при 65 ° C с частым перемешиванием, чтобы шарики оставались суспендированными в растворе.
6. Количество продукта в отрицательном контроле кроличьего IgG-IP и положительном контроле в реакциях ПЦР на гистон h4-IP эквивалентно.	В реакцию IP добавлено слишком много или недостаточно хроматина. В качестве альтернативы, в реакцию IP добавлено слишком много антител. Слишком много ДНК добавлено в реакцию ПЦР или слишком много циклов амплификации.	Добавьте не более 15 мкг хроматина и 10 мкл антитела к гистону h4 в каждую реакцию IP. Уменьшите количество нормального кроличьего IgG до 1 мкл на IP. Добавьте меньше ДНК в реакцию ПЦР или уменьшите количество циклов ПЦР. Очень важно, чтобы продукты ПЦР анализировались в рамках фазы линейной амплификации ПЦР. В противном случае невозможно точно измерить разницу в количествах исходной ДНК.
7. В реакции ПЦР экспериментальное антитело-IP нет продукта.	В реакцию ПЦР добавлено недостаточно ДНК. В реакцию IP добавлено недостаточно антител. Антитело не работает для IP.	Добавьте больше ДНК в реакцию ПЦР или увеличьте количество циклов амплификации. Обычно к IP-реакции добавляют от 1 до 5 мкг антитела; однако точное количество сильно зависит от индивидуального антитела. Увеличьте количество антител, добавленных к IP. Найдите альтернативный источник антител.

опубликовано в декабре 2011 г.

Пересмотрено в июне 2018 г.

4 New Magnum Plus Balancing Beads Compound MTP250 Сумки по 8 унций

Описание продукта

New Magnum Plus Balancing Beads Compound MTP250 Сумка на 8 унций

Посмотрите видео о том, как работают балансирующие бусины

Таблица применения размера балансировочного мешка для бисера в зависимости от размера шины
РАЗМЕР	МАГНУМ	РАЗМЕР	МАГНУМ	РАЗМЕР	МАГНУМ
700R15	LTP100	265 / 85R16	LTP150	10R17.5	MTP250
7.50R15	LTP150	265 / 75R16	LTP150	11R17,5	MTP250
8.25R15	LTP200	265 / 70R16	LTP150	195 / 70R17,5	LTP150
9R15	LTP200	275 / 85R16	LTP150	195 / 60R17.5	LTP100
10R15	MTP250	275 / 70R16	LTP150	205 / 80R17,5	LTP150
205 / 75R15	LTP100	285 / 75R16	LTP150	205 / 75R17.5	LTP150
215 / 75R15	LTP100	295 / 75R16	LTP150	205 / 60R17,5	LTP150
225 / 75R15	LTP100	305 / 70R16	LTP150	215 / 75R17.5	LTP150
225 / 70R15	LTP100	305 / 65R16	LTP150	215 / 70R17,5	LTP150
225 / 60R15	LTP100	315 / 75R16	LTP150	225 / 90R17.5	LTP200
235 / 75R15	LTP100	315 / 70R16	LTP150	225 / 80R17,5	LTP150
235 / 70R15	LTP100	345 / 65R16	LTP150	225 / 75R17.5	LTP150
265 / 70R15	LTP100			225 / 60R17,5	LTP100
315 / 70R15	LTP100	8R16.5	LTP100	235 / 75R17,5	LTP200
325 / 60R15	LTP100	8.75R16.5	LTP100	235 / 70R17.5	LTP150
		9.50R16.5	LTP150	245 / 75R17,5	LTP200
185 / 70R15.5	LTP100
		225 / 65R17	LTP100	7.50R18	MTP250
7.50R16	LTP100	225 / 60R17	LTP100	245 / 60R18	LTP150
8.25R16	LTP200	225 / 55R17 *	LTP100	255 / 70R18	LTP150
11R16	MTP300	235 / 80R17	LTP150	255 / 60R18	LTP150
175 / 75R16	LTP100	235 / 75R17	LTP150	255 / 55R18 *	LTP150
195 / 75R16	LTP100	235 / 65R17	LTP100	265 / 70R18	LTP200
195 / 65R16	LTP100	235 / 60R17	LTP100	265 / 60R18	LTP200
205 / 80R16	LTP100	245 / 75R17	LTP150	275 / 65R18	LTP200
215 / 85R16	LTP100	245 / 70R17	LTP150	275 / 60R18	LTP200
215 / 70R16	LTP100	245 / 65R17	LTP150	275 / 55R18 *	LTP200
215 / 65R16	LTP100	255 / 75R17	LTP200	285 / 65R18	LTP200
215 / 60R16	LTP100	255 / 70R17	LTP150	285 / 60R18	LTP200
225 / 85R16	LTP100	255 / 65R17	LTP150	285 / 55R18 *	LTP200
225 / 75R16	LTP100	255 / 60R17	LTP150	285 / 50R18 *	LTP200
225 / 70R16	LTP100	255 / 55R17 *	LTP150	325 / 65R18	LTP200
225 / 65R16	LTP100	255 / 50R17 *	LTP150	325 / 60R18	LTP200
225 / 60R16	LTP100	265 / 70R17	LTP150	355 / 65R18	LTP200
235 / 85R16	LTP150	265 / 65R17	LTP150
235 / 75R16	LTP150	275 / 70R17	LTP200	255 / 55R19 *	LTP150
235 / 70R16	LTP150	275 / 65R17	LTP200	255 / 50R19 *	LTP150
235 / 60R16	LTP100	275 / 60R17	LTP200	275 / 45R19 *	LTP150
245 / 85R16	LTP150	275 / 55R17 *	LTP200	285 / 45R19 *	LTP150
245 / 75R16	LTP150	285 / 70R17	LTP200
245 / 70R16	LTP150	285 / 60R17	LTP200	255 / 50R20 *	LTP200
245 / 65R16	LTP100	305 / 70R17	LTP200	275 / 65R20	LTP200
245 / 50R16 *	LTP150	315 / 70R17	LTP200	275 / 60R20	LTP200
255 / 85R16	LTP150			275 / 55R20 *	LTP200
255 / 70R16	LTP150	8R17.5	LTP150	275 / 40R20 *	LTP200
255 / 65R16	LTP150	8.5R17.5	LTP200	285 / 55R20 *	LTP200
255 / 55R16 *	LTP150	9.5R17.5	LTP200	285 / 50R20 *	LTP200
РАЗМЕР	МАГНУМ	РАЗМЕР	МАГНУМ	РАЗМЕР	МАГНУМ
305 / 50R20 *	LTP200	35/12.50R16.5	LTP200	11 / 70R22,5	MTP300
315 / 35R20 *	LTP200	35 / 14.50R16.5	MTP250	12R22.5	MTP400
325 / 60R20	LTP200	36 / 16.50R16.5	MTP250	13R22,5	MTP500
355 / 60R20	LTP200	37/12.50R16.5	MTP250	15R22,5	MTP500
355 / 50R20 *	LTP200	38 / 15.50R16.5	MTP250	16R22.5	DPP600
		40 / 17B 16,5	MTP300	16,5R22,5	DPP600
285 / 35R22 *	LTP200	44/18.50B16.5	MTP400	18R22,5	DPP700
305 / 40R22 *	LTP200			235 / 80R22,5	LTP200
305 / 45R22 *	LTP200	33/12.50R17	LTP200	235 / 75R22,5	LTP200
325 / 50R22 *	LTP200	35 / 12.50R17	LTP200	235 / 70R22.5	LTP200
335 / 55R22 *	LTP200	37 / 12.50R17	MTP250	245 / 75R22,5	MTP250
		37/13.50R17	MTP250	255 / 80R22,5	MTP250
		40 / 13.50R17	MTP250	255 / 70R22,5	MTP250
ВНЕДОРОЖНИК				265 / 75R22.5	MTP250
30 / 9.5R15	LTP100	35 / 12.50R18	LTP200	265 / 70R22,5	MTP250
31/10.50R15	LTP150	37 / 12.50R18	MTP250	275 / 80R22,5	MTP300
31 / 11.50R15	LTP150	37/12.50R20	MTP250	275 / 70R22,5	MTP300
31 / 12.50R15	LTP150	СРЕДНИЙ TR		275 / 50R22,5	MTP250
31/14.50R15	LTP200	8R19,5	LTP200	285 / 75R22,5	MTP300
32 / 11.50R15	LTP150	9R19,5	MTP250	285 / 60R22.5	MTP250
32 / 12.50R15	LTP200	18R19,5	DPP600	295 / 80R22,5	MTP400
33/9.50R15	LTP150	225 / 70R19,5	LTP200	295 / 75R22,5	MTP300
33 / 10.50R15	LTP150	245 / 70R19.5	LTP200	295 / 60R22,5	MTP300
33 / 12.50R15	LTP200	265 / 70R19,5	MTP250	305 / 70R22.5	MTP300
33 / 14.50R15	LTP200	275 / 70R19,5	MTP250	305 / 60R22,5	MTP300
33/16.50R15	MTP250	285 / 75R19,5	MTP300	315 / 80R22,5	MTP500
35 / 12.50R15	LTP200	285 / 70R19.5	MTP250	315 / 75R22,5	MTP400
35 / 13.50R15	LTP200	305 / 70R19,5	MTP300	315 / 70R22.5	MTP400
36 / 12.50R15	LTP200	385 / 65R19,5	MTP400	315 / 60R22,5	MTP400
36/14.50R15	MTP250	445 / 65R19,5	DPP600	345 / 75R22,5	MTP500
36 / 16.50R15	MTP250	7.50R20	MTP250	350 / 75R22,5	MTP500
37 / 12.50R15	LTP200	8.25R20	MTP250	365 / 80R22.5	MTP500
38 / 15.50R15	MTP250	9.00R20	MTP300	365 / 70R22,5	MTP500
40 / 17B15	MTP300	10.00R20	MTP300	385 / 65R22,5	MTP500
44 / 18.50B15	MTP400	11.00R20	MTP400	385 / 55R22.5	MTP500
		12.00R20	MTP500	425 / 65R22,5	DPP600
31 / 12.50R16	LTP150	12.5R20	MTP500	445 / 65R22,5	DPP700
32 / 9.50R16	LTP150	13 / 80R20	MTP400	445 / 50R22.5	DPP600
32 / 12.50R16	LTP200	14 / 80R20	MTP500	455 / 55R22,5	DPP600
33/12.50R16	LTP200	14.00R20	MTP500
34 / 12.50R16	LTP200	365 / 80R20	MTP500	11.00R24	MTP400
33 / 14.50R16	LTP200	395 / 80R20	DPP600	12.00R24	MTP500
35/10.50R16	LTP200			14.00R24	DPP600
35 / 12.50R16	LTP200	525 / 65R20,5	DPP600	445 / 70R24	DPP700
36/12.50R16	LTP200	615 / 65R20,5	DPP600	495 / 70R24	DPP700
36 / 14.50R16	MTP250
37/12.50R16	MTP250	10.00R22	MTP400	11R24,5	MTP300
38 / 15.50R16	MTP250	11.00R22	MTP400	12R24.5	MTP400
				275 / 80R24,5	MTP300
33 / 12.50R16.5	LTP200	9R22,5	LTP200	285 / 75R24.5	MTP300
33 / 14.50R16.5	LTP200	10R22,5	MTP300	295 / 80R24,5	MTP400
33/16.50R16.5	LTP200	11R22,5	MTP300	305 / 75R24,5	MTP400

Вольфрамовые изделия | Вольфрамовые бусины Plus

Вольфрамовые бусины с малыми прорезями

От: 2 фунта стерлингов.95 Узнать больше

Металлические цветные вольфрамовые бусины (потайные)

От: 3,28 фунта стерлингов Узнать больше

Металлические вольфрамовые бусины с маленькими шлицами

От: 3,49 £ Узнать больше

COUNTERSUNK Бусины из вольфрама с металлическим покрытием

От: 2 фунта стерлингов.18 Узнать больше

Вольфрамовые бусины с потайной краской

От 2,49 фунтов стерлингов Узнать больше

Вольфрамовые бусины с металлическим покрытием

От: 2,18 фунтов стерлингов Узнать больше

Креветки Chevron Flexi Shrimps Гибкие вольфрамовые креветки

От 7 фунтов стерлингов.40 Узнать больше

Шевронные гибкие конусы Гибкие вольфрамовые конусы

От: 4,80 фунтов стерлингов Узнать больше

Шевронные бусины Flexi Beads Гибкие вольфрамовые бусины

От: 4,80 фунтов стерлингов Узнать больше

Вольфрамовые креветки

От: 2 фунта стерлингов.19 Узнать больше

Вольфрамовые бусины для диско-шара (с прорезями)

От: 3,02 фунта стерлингов Узнать больше

Спинки для вольфрамовых шаблонов

От 1,96 £ Узнать больше

Вольфрамовые гантели

От: 2 фунта стерлингов.75 Узнать больше

Вольфрамовые слезные капли

От: 2,75 фунтов стерлингов Узнать больше

Вольфрамовые манжеты

£ 1.99 Нет в наличии Узнать больше

Шевронные трубки из лосося Гибкие вольфрамовые трубки

8 фунтов стерлингов.45 Нет в наличии Узнать больше

Parent Plus: водопоглощающие шарики могут причинить вред при проглатывании, положить в ухо

Водопоглощающие гелевые шарики выглядят как леденцы, поэтому у детей может возникнуть соблазн проглотить их.

Водопоглощающие гелевые бусины продаются как детские игрушки и используются в вазах и садах. растущая проблема среди маленьких детей.

Нетоксичные водяные шарики называются желейными шариками, водяными шарами, гидро-шариками, полимерными шариками. бусины и гелевые бусины.Когда крошечные твердые пластиковые шарики помещаются в воду, они могут вырастают до 200 раз своего размера. Прозрачные красочные бусины можно сушить и использовать повторно.

Поскольку они похожи на конфеты, у детей может возникнуть соблазн их проглотить. Дети тоже вложили их в уши.

«Эти объекты могут увеличиваться в размерах по мере прохождения через кишечник, в конечном итоге прокладывает путь к обструкции », — сказала Дженифер Лайтдейл, доктор медицины, магистр здравоохранения, FAAP, педиатрическая больница. гастроэнтеролог.Бусинки могут быть не видны на рентгеновских снимках.

В феврале Комиссия по безопасности потребительских товаров США (CPSC) получила уведомление о два случая, когда 5-летний и 7-летний ребенок вставляли бусинки в уши. Их врачи не могли видеть прозрачные бусинки и думали, что у детей ушная инфекция. Детей лечили антибиотиками и ушными каплями, но это не помогло. симптомы. Врачи наконец обнаружили проблему после того, как бусинки расширились. до ¾ дюйма и пришлось удалить хирургическим путем.У обоих детей повреждена барабанная перепонка, и у одного необратимая потеря слуха.

С 2012 года нескольким детям потребовалась неотложная помощь после проглатывания шариков. В прошлом году двухлетняя девочка проглотила около 100 маленьких водяных бусинок. Бусины расширились размером с шарики, и ей потребовалось девять часов, чтобы передать их в экстренной ситуации отделение. Другой ребенок перенес операцию по удалению ныне вспоминаемого водопоглощающего шара. который мог вырасти до размеров ракетки.

В 2012 и 2013 годах смерть детей за границей и травмы в США стали причиной CPSC выдает в добровольном порядке несколько видов водопоглощающих шариков, бус. и игрушки в форме фруктов и животных (http://bit.ly/1WLS5C0 и http://bit.ly/21us7WP). Подобные товары до сих пор продаются в магазинах для рукоделия и садовых центрах.

Признаки того, что проглатывание шариков вызывает закупорку, могут включать отказ от еды, слюнотечение, рвота, хрипы, жалобы на то, что что-то застряло в горле или груди, брюшной полости боль, запор, вздутие и болезненность живота.Если вы подозреваете, что ваш ребенок проглотил или поместили бусинки в уши, немедленно обратитесь за медицинской помощью.

Последние статьи Parent Plus

Авторские права © 2016, Американская академия педиатрии

Узоры с бисером плюс бесплатный узор для печати

У нас столько разных видов бусин! Мы используем их все время. Для подсчета, вычитания, узоров и просто создания простых вещей! Сегодня, в рамках серии «Учись со своим ремесленным тайником», у меня есть для вас несколько бесплатных печатных карточек с выкройками, которые идеально подходят для любых видов бусин.Они особенно хорошо смотрятся с забавным набором бусин, который мы нашли в магазине для рукоделия на весну!

Материалы, необходимые для задания «Бесплатная печать выкройки»:

Бумага и / или карточки

Пакеты для ламинирования (опционально)

Книжное кольцо

Пуансон на одно отверстие

Лоток

Бусины разных цветов и стилей

Очистители труб

Соберите карты:

Распечатайте и разрежьте бесплатные карточки с рисунком для печати.Я напечатал свою на картоне, поэтому нам не нужно было ламинировать, но если вы используете бумагу для принтера, вам нужно будет ламинировать, чтобы карты были более долговечными.

Проделайте отверстие в верхнем левом углу каждой карточки и затем поместите карточки на книжное кольцо.

Воспользуйтесь бесплатными печатными шаблонами карточек:

Покажите карты, бусинки и очистители трубок на лотке.

Продемонстрируйте, как наложить разные бусинки на каждый из цветных кружков в самом верху карточки с выкройкой.

Следуя цветовому коду, наденьте бусинки на приспособления для очистки труб, как показано на рисунке. (Не любите моего дошкольника!)

Построение паттернов — важный математический навык и строительные блоки критического мышления.

Использование бусинок для выкройки также дает возможность отработать мелкую моторику, что необходимо людям любого возраста.

Хотите узнать больше о бусах? Ознакомьтесь с этими замечательными постами из серии «Учитесь с вашим ремесленным тайником»!

Еще один отличный способ потренироваться в нанесении бусинок и разработать свои собственные выкройки!

Отличные идеи использования бус для математики и развития мелкой моторики!

У вас развлекается обучающая деятельность с использованием бус? Свяжите это здесь !!

[inlinkz_linkup id = 518066 mode = 1]

Обязательно ознакомьтесь со всеми другими замечательными идеями для «Обучение с помощью своего ремесленного тайника»!

.