Что в голове у бактериофага • Галина Клинк • Научная картинка дня на «Элементах» • Вирусология
На этой микрофотографии, сделанной при помощи криоэлектронного микроскопа, запечатлена икосаэдрическая головка бактериофага (вируса, поражающего бактерии) Т4. Т4 специализируется на энтеробактериях, в том числе на кишечной палочке (Escherichia coli). Это довольно крупный бактериофаг, его ширина составляет примерно 90 нм, а длина — 200 нм. Красные сгустки внутри головки на фото — это плотно упакованная ДНК. Собственно, кроме ДНК в головке фага ничего и нет, только белковая оболочка — капсид.
Геном фага Т4 огромен, он содержит 168 903 пар нуклеотидов — всего в 30 раз меньше, чем геном его хозяина, кишечной палочки Escherichia coli. Для сравнения, длина генома папилломавируса человека — 8000 пар нуклеотидов. Что же кодирует такая длинная ДНК бактериофага и как она вообще умещается в головку вируса?
Фаг Т4 — один из самых сложно устроенных вирусов. Он несет в своей ДНК около 300 белок-кодирующих генов, причем из них только 69 необходимы ему для выживания в стандартных условиях лаборатории. Большинство белков фага Т4 не похожи на известные белки других организмов. Но есть и такие, чьи родственники найдены у прокариот и эукариот. Функции многих белков этого вируса до сих пор не установлены, одна только головка состоит по крайней мере из 12 типов белков. Кроме белков, ДНК бактериофага кодирует несколько транспортных РНК и коротких регуляторных РНК — свойство, обычное для самостоятельных организмов, но не распространенное среди вирусов.
В ходе инфекции бактериофаг Т4 полностью переключает работу клеточных систем хозяина на свои нужды. В этом паразиту помогают собственные ферменты для синтеза нуклеотидов, репликации (удвоения) и репарации (починки от повреждений) ДНК и множество других белков. Например, у Т4 есть белок, который попадает в бактерию вместе с ДНК фага и на ранних этапах инфекции модифицирует РНК-полимеразу (основной белок транскрипции — «переписывания» генетической информации с ДНК на РНК) бактерии так, что фермент охотнее взаимодействует с ДНК вируса, чем с ДНК клетки. Это способствует синтезу белков, необходимых фагу в начале инфекции. Позже другой белок модифицирует полимеразу так, что она начинает охотнее взаимодействовать с генами фага Т4, нужными на следующем этапе. И наконец, после очередной модификации, РНК-полимераза бактерии начинает взаимодействовать с так называемыми «поздними» генами Т4.
Другой интересный пример — белок, который встраивается во внутреннюю мембрану клетки-хозяина (у кишечной палочки, как у любой уважающей себя грамотрицательной бактерии, есть две клеточные мембраны) и не дает генетической информации других бактериофагов попасть внутрь. Есть у Т4 и белки, разрезающие ДНК бактерии-хозяина и проникших в нее других бактериофагов. С ДНК Т4 эти белки они не связываются, поскольку в ее состав вместо нуклеотида цитозина входит модифицированный гидроксиметилцитозин.
Отдельного внимания заслуживают белки, необходимые для синтеза новых вирионов (вирусных частиц) и для упаковки в них ДНК. Более 40% белков фага Т4 вовлечены в сборку вириона, состоящего из головки и сокращающегося хвоста с хвостовыми нитями для прикрепления к бактерии. Вирион устроен так сложно, что у Т4 есть специальные «белки строительных лесов», создающие каркас для сборки головки и удаляющиеся из нее при созревании.
Пока точно не известно, каким образом настолько огромная молекула ДНК укладывается в вирусной головке. Зато известно, что она затаскивается внутрь действием белкового «мотора», что сопряжено с гидролизом «энергетической молекулы» — АТФ. Весь геном Т4 проталкивается в головку за пять минут.
Ученые уже пытаются «научить» Т4 упаковывать в свою головку чужеродные нуклеиновые кислоты или белки. Предполагают, что таким образом можно доставлять молекулярные грузы в конкретные эукариотические клетки.
Фото с сайта cgl.ucsf.edu.
О криоэлектронном микросопе см. также:
Нобелевская премия по химии — 2017, «Элементы», 12.10.2017.
О бактериофагах см. также:
Бактериофаги: 100 лет на службе человечеству, «Наука из первых рук» №4, 2016.
Пожиратели бактерий, «Популярная механика» №10, 2013.
Галина Клинк
Бактериофаги в ассортименте аптеки
Если имеется крупная колония бактерий, где своих жертв найдут и следующие поколения фагов, то уничтожение бактерий литическими (убивающими, дословно — растворяющими) фагами идет быстро и непрерывно. Если потенциальных жертв мало или внешние условия не слишком подходят для эффективного размножения фагов, то преимущество получают фаги с лизогенным циклом развития. В этом случае после внедрения внутрь бактерии ДНК фага не сразу запускает механизм инфекции, а до поры до времени существует внутри клетки в пассивном состоянии, часто внедряясь в бактериальный геном. В таком состоянии профага вирус может существовать долго, проходя вместе с хромосомой бактерии циклы деления клетки. И лишь, когда бактерия попадает в благоприятную для размножения среду, активируется литический цикл инфекции. При этом, когда ДНК фага освобождается из бактериальной хромосомы, часто захватываются и соседние участки бактериального генома, а их содержимое в дальнейшем может перенестись в следующую бактерию, которую заразит бактериофаг. Этот процесс (трансдукция генов) считается важнейшим средством переноса информации между прокариотами — организмами без клеточных ядер.ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ В МЕДИЦИНЕ
Исторически сложилось, что СССР занимал лидирующие позиции в области производства и применения лечебно-профилактических бактериофагов. Применение бактериофагов при лечении инфекционных заболеваний началось почти сразу после открытия самих бактериофагов, однако широкие испытания этих противобактериальных средств начали проводиться в СССР только в конце 1930-х гг. В результате была доказана эффективность препаратов бактериофагов как профилактического средства при борьбе с эпидемиями дизентерии и холеры, а использование их при лечении ран и гнойно-воспалительных процессов показало их потенциал как альтернативы антибиотикам.
Однако результаты исследований тех времен были зачастую противоречивы: иногда фаги сразу подавляли развитие инфекционных процессов, но иногда оказывались бесполезными. Специалисты сразу поняли, в чем причина: лечение было успешным лишь тогда, когда использовались фаги, способные инфицировать именно тот бактериальный штамм, который и вызвал заболевание. Поэтому при возникновении эпидемии требовалось выделить инфекционный агент, проверить на нем имеющиеся фаговые препараты и запустить в производство в качестве препарата наиболее эффективный бактериофаг.
Столетняя история фаготерапии бактериальных инфекций такова, что основные клинические испытания были проведены задолго до разработки надежной экспериментальной модели инфекционной патологии на лабораторных животных и внедрения в медицинскую практику для вновь регистрируемых лекарственных средств высоких стандартов двойного слепого плацебо-контролируемого исследование. С появлением антибиотиков интерес к фагам был утрачен, но после появления антибиотикоустойчивых штаммов бактерий в разных странах начали разрабатывать фаговые препараты и вновь проводить их испытания. Этому способствует и развитие новых представлений в конце ХХ — начале ХХI в. как о молекулярной биологии, так и об экологических взаимоотношениях бактериофагов и их хозяев.
Сейчас бактериофаги в медицинской практике применяется в диагностике, лечении и профилактике инфекционных заболеваний.
Фагодиагностика (фагоиндикация) – выделение бактериофагов из организма больного и объектов внешней среды (что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий). В процессе диагностики важно проводить фагоидентификацию, которая включает в себя:
— фагодифференцировку — установление вида (идентификация) бактерий по их чувствительности к известному фагу;
— фаготипирование – установление типа — внутривидовое типирование бактерий по их чувствительности к типовым бактериофагам (важно для эпидемиологического анализа заболевания – установление источника и путей распространения заболевания).
Фаготерапия – применение бактериофагов с целью лечения инфекционных заболеваний (например, пиобактериофаг, дизентирийный и синегнойный бактериофаги).
Фагопрофилактика – применение бактериофагов с целью предупреждения заболеваний в эпидемическом очаге (например, дизентерийный, сальмонеллезный и стафилококковый бактериофаги). В настоящее время фаги применяются для экстренной профилактики брюшного тифа и дизентерии. Под экстренной профилактикой понимается комплекс мероприятий для предотвращения развития болезни до и/или непосредственно после процесса инфицирования.
Достоинств у бактериофагов как потенциальных лекарств множество, но и недостатков не мало. К несомненным достоинствам относится, во-первых, их большое количество, на фоне этого всегда можно подобрать подходящий бактериофаг. Во‑вторых, бактериофаги строго специфичны, то есть они уничтожают только определенный вид микробов, не угнетая при этом нормальную микрофлору человека. В-третьих, когда бактериофаг находит бактерию, которую должен уничтожить, он в процессе своего жизненного цикла начинает размножаться. Таким образом, не столь острым становится вопрос дозировки. В-четвертых, бактериофаги не вызывают побочных эффектов. Все случаи аллергических реакций при использовании терапевтических бактериофагов были вызваны либо примесями, от которых препарат был недостаточно очищен, либо токсинами, выделяющимися при массовой гибели бактерий.
Проблемы применения бактериофагов проистекают из их достоинств. Прежде всего высокая специфичность бактериофагов требует точной диагностики патогенного микроба вплоть до штамма. Например, препарат, сделанный против определенного набора штаммов и прекрасно лечащий стрептококковую ангину в Смоленске, может оказаться бессильным против по всем признакам такой же ангины в Кемерово, так как болезнь могут вызывать разные штаммы бактерий. Фагодиагностика с использованием быстрых методов типирования внедряется медленно из-за дороговизны аппаратуры. В идеальных условиях терапия бактериофагами должна проводиться с использованием принципов персонализированной медицины, к чему современная отечественная медицина практически не готова.
Другой важный недостаток фагов — их биологическая природа. Кроме того, что бактериофаги для поддержания жизнеспособности требуют особых условий хранения и транспортировки, такой метод лечения открывает простор для множества спекуляций на тему «посторонней ДНК в человеке». И хотя известно, что бактериофаг в принципе не может заразить человеческую клетку и внедрить в нее свою ДНК, поменять общественное мнение непросто. Из биологической природы и довольно большого, по сравнению с низкомолекулярными лекарствами (теми же антибиотиками), размера вытекает третье ограничение — проблема доставки бактериофага в организм. Если микробная инфекция развивается там, куда бактериофаг можно приложить напрямую в виде капель, спрея или клизмы, — на коже, открытых ранах, ожогах, слизистых оболочках носоглотки, ушей, глаз, толстого кишечника — то проблем не возникает. Но если заражение происходит во внутренних органах, ситуация сложнее. Случаи успешного излечения инфекций почек или селезенки при обычном пероральном приеме препарата бактериофага известны. Но сам механизм проникновения относительно крупных (100 нм) фаговых частиц из желудка в кровоток и во внутренние органы изучен плохо и сильно разнится от пациента к пациенту. Бактериофаги бессильны и против тех микробов, которые развиваются внутри клеток, например, возбудителей туберкулеза и проказы. Через стенку человеческой клетки бактериофаг пробраться не может.
Сравнительные возможности терапии фагами и антибиотиками представлены в таблице ниже.
Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda
Штаммы бактерий, фагов и плазмид:
Штамма LE392 является supF. Он был выбран для подавления SAM7 мутаций в геноме фага (см. Таблицу 1 для подробностей). Таким образом, индуцированные лизогенов в конечном итоге лизиса и отпустите частиц фага, так же как инфицированные клетки, которые выбрали литического пути. Лизогенных клетках, выращенных при 30 ° C в связи с наличием чувствительных к температуре CI 857 аллелей в геноме фага. После тепловой индукции, GPD-EYFP и дикого типа GPD будут совместно выразили из генома λ LZ1 и плазмиды pPlate * D соответственно. В результате капсида вновь созданного фага λ LZ2 содержит смесь GPD-EYFP и ВВП белков. Эта мозаика фага является грубой и достаточно флуоресцентные, чтобы обнаружить отдельные фаги 5. рр RE — mCherry, корреспондент плазмиды используются для обнаружения выбор лизогенных pathwaу. RE промотора P активируется CII при установлении лизогении 1,11. рр RE — mCherry 5 была получена из ПЭ-GFP 11 по замене GFP с mCherry 12. Для получения дополнительной информации см. наши предыдущие работы 5.
Параметры роста Состояние:
Во время индукции lysogen (раздел 1), легкая тряска при 180 оборотов в минуту дает хороший выход вируса 13. Использование глюкозы в питательной среде следует избегать, поскольку метаболизм глюкозы создает кислую продуктов обмена веществ, и зрелых частиц лямбда неустойчивы при кислом рН 13. Добавление MgSO 4, направленные на стабилизацию капсида фага 3. Для проведения фагов дикого типа CI (CI вместо 857), lysogen может быть вызвано использованием ДНК-повреждающих агентов митомицин C 3. В шаге 1.3, инкубации при 37 ° C обычно не должна превышать 90 минут. Это USEF ул проверить плотность клеток на OD 600 каждые 30 мин. Для хорошего лизат, OD 600 падает до 0,2 или меньше, а оставшиеся OD 600 является результатом клеточного мусора. Инкубация слишком долго может привести к снижению доходности фагов, так как вновь созданные фага может начать вводить свою ДНК в клетку мусора. Для получения видимого диапазона фага (по крайней мере, 1 х 10 11 частиц фага) с шагом 2,11 и 2,13, расти по меньшей мере 500 мл культуры в шаге 1.2. Кроме того 0,2% мальтозы в ростовой среде в шагах 5.1 и 5.2 направлена на индукции выражение из баранины, рецептор для адсорбции фага лямбда 3,14. 1000-кратного разведения вместо 100-кратного в шаге 5,2 направлена на снижение уровня mCherry фон от репортера плазмиды RE PP — mCherry. В шаге 5.5 для инъекции ДНК фага запуска, 35 ° C выбрана, чтобы избежать индукции чувствительные к температуре cI857 аллеля.
Фаг Очистка:
jove_content «> фага стадии очистки (шаги 2.1 через 2,11) может быть заменен другими протоколами очистки 5, однако окончательное ультрацентрифугирования через CsCl равновесный градиент (Шаги 2.12 и 2.13) неизбежна. Бакет-роторы необходимые шаги в 2,10 и 2,12 до обеспечить резкое видимых полос фага. Получение чистой складе фага может легко занять до недели, так что необходимо проверить титр фага по пути, чтобы убедиться, что все идет не так во время промежуточных шагов.Фаг-разгрузочные работы:
Во время всех процедур очистки в разделе 2, очень важно для обработки фага лизата осторожно, чтобы избежать сдвига фага хвосты из фага головы. В ячейке инфекции в разделе 5 (например, шаги 5.5 через 5,7), важно также, чтобы избежать сдвига фаговых частиц из инфицированных клеток. Заметим, что если фаг стриженый от инфицированной клетки после введения его ДНК, в результате «темных» инфекцию, то есть винфекцией результат будет наблюдаться в эксперименте, но заражение фагом не будет. Чтобы свести к минимуму такие проблемы, мы используем широкий наконечник пипетки при обработке фагов или фаг / смеси клеток.
DAPI тестирования:
Окрашивание фага акции с DAPI (раздел 4) представляет собой быстрый и эффективный метод, чтобы проверить чистоту фага акций. Она также может быть использована для проверки возможного ухудшения существующего фонда фага с течением времени. Для чистого акции, ко-локализацию YFP и DAPI сигналов под флуоресцентным микроскопом должна быть близка к 100%. Как правило, мы видим, что менее 1% из мест YFP не содержат DAPI (представляющих капсид без вирусного генома), который указывает, что эти частицы не удалось успешно упаковать вирусной ДНК или уже вводят свою ДНК в другом месте. Менее 1% пятен DAPI не содержат YFP (соответствующий нефлуоресцентного фаги). Если это не так, то Шаги 2,12 через 2,14 необходимости повторять в оrder, чтобы очистить еще раз. Что касается визуализации параметров, микроскоп установки в шаге 4.3, не так критично, как в разделе 5, потому что нет долгосрочных живых клеток изображений здесь не требуется. Однако, сохранив те же параметры микроскопа, как и в разделе 5 полезна, если кто-то хочет, чтобы откалибровать интенсивности флуоресценции одной частицы фага. Если PBS-агарозы плиты не очень чистые, или слишком много DAPI краситель используется, некоторые DAPI пятна, соответствующие ДНК фага может быть окружен с «гало». Если слишком мало DAPI краситель используется, сигнал из канала DAPI может быть очень слабым.
Микроскоп система:
Для изображений в разделе 6, мы используем коммерческий инвертированный микроскоп эпифлуоресцентной (Eclipse TE2000-E, Nikon) с целью 100x (план Fluo, числовая апертура 1,40, масло погружение) и стандартный набор фильтров (Nikon). Флуоресценции источником света является дуговая лампа с контролем интенсивности света. Следующие функции компьютерного управления: X, Y и Z роsition; светлого поля и флуоресценции ставни, и флуоресцентный фильтр выбора. Автофокус функция не требуется. В противном случае фокус может легко отойти в замедленной фильма (обычно 4 часа). Возможность приобрести несколько (х, у) позиции в каждый момент времени является полезной, поскольку она позволяет проследить несколько событий инфекции в параллель. Мы обычно приобретают 8 финала позиции в каждом фильме, следуя до 100 событий инфекции. Камеры мы используем охлаждением ПЗС-матрицей с 512х512 16х16 мкм камера с динамическим диапазоном 16 бит (Cascade512, Фотометрия). Приобретение осуществляется с помощью программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices). Микроскоп должен быть помещен в контролируемой температурой комнаты, в качестве альтернативы, микроскоп должен быть окружен с контролируемой температурой камеры.
Image Acquisition:
Для живых клеток изображениями, очень важно, чтобы избежать ненужного воздействия на образец, который может привести к обесцвечиванию и фоtotoxicity. Поэтому лучше сначала охарактеризовать вашу систему, чтобы найти оптимальную освещенность, которая позволяет флуоресцентной детекции хотя и не приводит к чрезмерному обесцвечивания или ингибирования роста клеток. Для получения хорошего изображения флуоресценции, играть с интенсивности возбуждающего света, время экспозиции камеры и усиления. В шага 6,2-6,3, 10 мин интервал кадров выбрано с целью минимизации воздействия света. В каждом кадре, только один в фокусе изображения необходимо в фазово-контрастный (для сотовых признания) и флуоресцентных каналов (для определения судьбы клеток). В первый момент времени, однако, несколько Z-положение изображения по каналу YFP требуется, чтобы захватить все заражении фагов на клеточной поверхности. YFP время экспозиции в начальный кадр может также должны быть выше, чем для покадровой фильма в более поздние сроки.
Анализ изображений:
Очень тщательно рассчитывать фагов частиц вокруг клеточной поверхности в шаге 7.1. Какотмечалось выше, мы принимаем ряд Z-стеки YFP через канал в шаге 6.2. Однако, это все еще может оставить некоторые флуоресцентные частицы фага вне фокуса, которая бросает вызов счета. Длина ячейки в начальной сроки измеряются с помощью программного обеспечения Metamorph. Длина ячейки также может быть измерена ImageJ или других программных средств. Кроме того, автоматизированный дом, построенный Matlab программа может быть очень полезным в получении информации, такой как флуоресценции со временем меняются вдоль клеточных клонов.
альтернативное решение для антибактериальной терапии животных
Использование антибиотиков для лечения болезней или стимуляторов роста у скота запрещено во многих странах мира в попытках решить проблемы, вызванные устойчивостью к антибиотикам. Поэтому для решения этой проблемы необходимо альтернативное решение. Бактериофаг может быть ответом, поскольку он показывает многообещающие эффекты для преодоления этого препятствия в животноводстве.
Антибиотики были впервые использованы в 1940-х годах и считались лучшим изобретением 20-го века. Однако устойчивые к антибиотикам бактерии быстро появились через несколько лет. В настоящее время в 2020 году миру угрожают бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, известные как «Супербаг».
В 2014 году Всемирная организация здравоохранения предупредила об опасности использования антибиотиков в кормах для скота, заявив, что «если антибиотики добавляются в корма для скота, они могут накапливаться у животных и в конечном итоге влиять на иммунную систему человека через пищевую цепь».
Запрет на антибиотики
Чтобы сократить использование антибиотиков, Европейский Союз впервые запретил использование антибиотиков в 2006 году. В Корее все стимуляторы роста были запрещены со второй половины 2011 года. В 2017 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) предложило новые рекомендации запретить антибактериальные препараты и разрешать только те антибиотики, которые прописаны ветеринарами для лечения заболеваний с учетом благополучия и здоровья животных.
Однако запрет на использование антибиотиков в животноводстве привел к таким проблемам, как снижение эффективности кормления, замедление роста и повышение смертности. Альтернатива антибиотикам необходима как для эффективного роста, так и для борьбы с бактериальными заболеваниями у животных.
Следовательно, каковы другие варианты, которые могут эффективно препятствовать проблемам, вызванным как устойчивостью к антибиотикам, так и болезнями домашнего скота?
Бактериофаг: естественный «пожиратель бактерий»
Бактериофаг — это природный антибактериальный компонент, который использовался еще до того, как были обнаружены антибиотики. По мере появления устойчивых к антибиотикам бактерий эффективность антибиотиков снижалась наряду с другими проблемами со здоровьем, угрожающими как человеку, так и животным. С тех пор бактериофаги привлекают большое внимание в качестве потенциального альтернативного решения. Итак, каковы характеристики и эффективность бактериофагов?
Бактериофаг — это вирус, который поражает бактерии. В отличие от других вредных вирусов, бактериофаги специально распознают и атакуют только бактерии и не влияют на людей или другие живые организмы и не наносят им вреда. Он имеет наибольшее количество частиц на Земле (1031 частица) и может существовать в различных средах, таких как морская вода, пресная вода, почва и пища.
Бактериофаг заражает бактерии, прикрепляясь к мембране бактериальной клетки и вводя свою генетическую информацию в бактериального хозяина. После этого бактериофаг размножается с использованием бактериальных машин-хозяев, что приводит к лизису бактерий через литический или лизогенный цикл. В этом действии бактерии убиваются бактериофагом (рисунок 1). В отличие от антибиотиков, которые могут быть неселективными, бактериофаги обладают высокой специфичностью к целевым хозяевам. Поскольку бактериофаги существуют в изобилии в природе, они могут развиваться в течение относительно короткого периода времени и с меньшими затратами, чем обычная разработка антибиотиков.
Рисунок 1 — Жизненный цикл литического бактериофага. Бактериофаг может эффективно уничтожать бактерии-мишени, и весь процесс занимает всего около 20 минут.
| 1 | Материалы научной студенческой конференции «Неделя студенческой науки» | В сборнике отражены вопросы изучения рассудочной деятельности животных, визуальной диагностики, физиологических особенностей, а также репродуктивной функции в области мелкого животноводства. Особое внимание уделено вопросам онкологии и биохимии. Приведена ветеринарно-санитарная оценка приправ и морепродуктов. | 26 ноября 2018 | Ссылка на сборник |
| 2 | Материалы научной студенческой конференции «Неделя студенческой науки» | В сборнике отражены базовые вопросы морфофункциональной анатомии органов и систем животных. Проанализировано генетическое и поведенческое разнообразие животных по породным и видовым критериям. Подробно представлены методы диагностики болезней животных. Приведены схемы лечения инвазионных болезней. Особое внимание уделено исследованию и увеличению продуктивных качеств, сравнительному анализу интерьерных и экстерьерных показателей в отечественной селекции. Рассмотрены вопросы биотехнологии пищевой промышленности, иммунологии и квантовой механики, а также применения культур клеток. | 03 марта 2020 | Ссылка на сборник |
| 3 | Материалы научной студенческой конференции «Неделя студенческой науки» | В сборнике отражены вопросы фармакологической эффективности препаратов для лечения болезней репродуктивной системы животных, изучены новейшие морфофункциональные особенности соматической, висцеральной и интегрирующей систем органов у различных видов животных. Отражены проблемы генетической инженерии и клонирования среди продуктивных животных. Проведена товарная оценка молочной и рыбной продукции, а также косметических средств, реализуемых в сетевых зоомагазинах Российской Федерации. Представлены способы применения иммуномодуляции мезенхимальными стволовыми клетками. Разработаны методы экспресс-диагностики в ветеринарной практике. | 07 апреля 2021 | Ссылка на сборник |
(PDF) Modern Approaches to the Methods of Creating of Phage Basis for Treatment-Prophylactic a Drug of Bacteriophages Pseudomonas aeruginosa
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (99)/2018
39
Оригинальные статьи
хлористого цезия [13]. Таксономическую принад-
лежность изучали с использованием электронного
микроскопа JEM-1400 (Jeol, Япония), оснащенно-
го цифровой камерой бокового ввода Veleta (SIS,
Германия).
Для проведения анализа генома штаммов бак-
териофагов Р. aeruginosa выделяли ДНК штаммов
бактериофагов методом экстракции фенол-хлоро-
формом с предварительной ферментативной об-
работкой РНКазой А, ДНКазой I и Протеиназой К
(Thermo Fisher Scientific, США) [14]. Далее прово-
дили гидролиз полученных фаговых ДНК различ-
ными эндонуклеазами рестрикции (HindIII, EcoRI,
EcoRV, PciI, NcoI, HpaI, MfeI, DraI, NotI) производ-
ства НПО «СибЭнзим» с целью получения рестрик-
ционных профилей для каждого из типируемых
бактериофагов. Использовали маркер 50 kb (п.н.:
48502, 39 936, 24730, 15 206, 10 000, 8000,
6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000,
750, 500, 250) НПО «СибЭнзим». Реакцию вели при
37 °С в течение 2–3 часов. Результаты гидроли-
за оценивали методом гель-электрофореза в 0,8%
агарозе.
Cеквенирование библиотек ДНК проводили
на платформе Illumina Miseq. Сборка нуклеотид-
ных последовательностей de novo была выполнена
с помощью пакета ABYSS. Поиск открытых рамок
трансляции (ОРТ), таксономическая и функцио-
нальная идентификация этих ОРТ была проведена
с помощью программного обеспечения MG-RAST
с использованием последовательностей ДНК, на-
ходящихся в базах данных GenBank и др.
Результаты и обсуждение
Из 34 проб сточной воды и почвы с исполь-
зованием 818 эпидемиологически значимых го-
спитальных и клинических штаммов бактерий P.
aeruginosa нами выделены 107 штаммов бактери-
офагов P. aeruginosa, из которых для дальнейших
исследований с учетом разнообразия регионов
выделения и особенностей морфологии негатив-
ных колоний были отобраны семь штаммов бак-
териофагов P. aeruginosa. Города и регионы,
представлены районами Сибири, Дальнего вос-
тока, и Европейской территорией России: РaUfa
№№ 1, 2 (г. Уфа), РaUfa № 3 (г. Хабаровск), РaUfa
№ 4 (г. Москва), РaUfa № 5 (г. Владивосток), РaUfa
№ 6 (г. Новосибирск), РaUfa № 7 (г. Иркутск).
Изучение биологических свойств семи отобран-
ных штаммов бактериофагов Р. aeruginosa пока-
зало, что все штаммы РaUfa № № 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7 в одиночном цикле внутриклеточного размно-
жения в бактериальных клетках характеризуются
литическим циклом развития, завершающимся фа-
голизисом бактерий и параметрами фаговой ин-
фекции, приведенными в таблице 1.
Известно, что у многих литических бакте-
риофагов фаголизис бактериальной клетки
Таблица 1.
Характеристики биологических свойств штаммов бактериофагов P.aeruginosa*
Штаммы бактериофагов
P. aeruginosa
Время максимальной адсорбции
бактериофагов на клетках бактерий
P.aeruginosa продуцентов фагов (мин)
Степень максимальной
адсорбции бактериофагов на клетках
бактерий P. aeruginosa-продуцентов
фагов (%)
Константа скорости адсорбции бактери-
офагов на клетках бактерий P. aeruginosa
-продуцентов фагов, (мл/мин)
Длительность латентного периода вну-
триклеточного размножения на клетках
бактерий P.aeruginosa-продуцентов
фагов, (мин)
Величина выхода фага из одной ин-
фицированной бактериальной клетки
P.aeruginosa (фаг. вирион/ бакт. кл)
Морфология негатив-
ных колоний штам-
мов бактериофагов
P.aeruginosa
Наличие и активность литического
фермента (Δ E, мм)
Спектр антибактериальной активности штаммов
бактериофагов P. aeruginosa, и их композиции
(% фагочувствительных штаммов бактерий
P.aeruginosa (из 818), выделенных в России и СНГ)
Диаметр
негатив-
ной коло-
нии (мм)
Ширина
зоны не-
полного
лизиса
(мм)
PaUfa- 1 5,9 ± 0,74 95,14 ± 0,84
(2,4 ± 0,14) х10-9
20 ± 0,7 82,6 ± 2,5 5,3 ± 0,44 1,24 ± 0,25 0,84 ± 0,08 51,0
PaUfa — 2 6 ± 0,61 95,9 ± 0,76
(2,95 ± 0,11) х10-9
19,3 ± 0,83 99,8 ± 1,3 6,1 ± 0,54 0,9 ± 0,1 0,78 ± 0,04 49,0
PaUfa — 3 9,1 ± 0,74 98,4 ± 0,58
(2 ± 0,12) х10-9
26,8 ± 3,5 11,6 ± 2,1 4,5 ± 0,5 0,96 ± 0,2 3,2 ± 0,27 11,4
PaUfa — 4 11 ± 0,89 90 ± 0,74
(6,79 ± 0,09) х10-8
35 ± 2 10 ± 1,6 2,3 ± 0,45 1,23 ± 0,24 2,8 ± 0,27 24,2
PaUfa — 5 11 ± 0,74 91,6 ± 2
(5,4 ± 0,2) х10-8
32,2 ± 4,1 10,8 ±1,9 1,24 ± 0,25 0,4 ± 0,2 3,2 ± 0,27 53,1
PaUfa — 6 10 ± 1,14 89,3 ± 1,2
(1,53 ± 0,12) х10-9
30 ± 5 12 ± 1 2,18 ± 0,21 нет нет 30,0
PaUfa — 7 7,7 ± 0,44 92,7 ± 0,98
(1,54 ± 0,1) х10-9
28,6 ± 2,2 19,6 ± 1,14 2,8 ± 0,21 1,8 ± 0,2 1,74 ± 0,29 17,4
Композиция из штаммов бактериофагов РaUfa № 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 91,7
Примечание:*С 1 по 9 столбец статистическую обработку проводили путем определения среднего значения и стандартного отклонения.
умереть от бактериофага или от антибиотика
Acinetobacter baumannii — опасный противник. Известный своей устойчивостью к высыханию, истощению запаса питательных веществ и дезинфектантам, A. baumannii тяжело поддается уничтожению, когда бактерия приживается на медицинских объектах [1]. Способный избегать воздействия многих антибиотиков, A. baumannii представляет серьезную проблему для врачей и медперсонала, которые лечат зараженных пациентов и ухаживают за ними [2]. Всемирной организацией здравоохранения эта угроза признана, а A. baumannii получил статус важнейшего приоритета для исследований и разработки новых противомикробных препаратов [3]. В статье «Устойчивые к бактериофагам Acinetobacter baumannii получили повторную чувствительность к противомикробным препаратам» авторами продемонстрировано, что фаги могут дать второе дыхание для применения антибиотиков, которые уже есть в распоряжении врачей.
Идея, лежащая в основе этого проекта, возникла после того, как первый автор, Джереми Барр, ныне заведующий лабораторией в Школе биологических наук университета Монаша в Австралии, принял участие в первом клинически успешном применении фаговой терапии против системного A. baumannii, зарегистрированного в США [4, 5]. После последовательного приема смесей фагов командой ученых были осуществлены три, казалось бы, не связанных между собой наблюдения. Во-первых, изолят A. baumannii, полученный от пациента, приобрел устойчивость к смеси фагов. Во-вторых, он потерял устойчивость к антибиотику миноциклину. В-третьих, было выявлено, что бактерии потеряли полисахаридную капсулу. Могут ли быть связаны эти обнаруженные явления? И если да, то как? Это и стало отправной точкой в исследовании ученых.
Чтобы собрать вместе детали головоломки, ученые использовали два филогенетически отдаленных клинических штамма A. baumannii и два разных бактериофага, выделенных из неочищенных сточных вод. Как сказал один из авторов, Фернандо Гордиллио Альтамирано, эта работа является свидетельством того, как часто его любовь к микробиологии подвергалась проверке на прочность при работе с образцами неочищенных сточных вод (их помещали в инкубатор на ночь, добавляя в пробирки богатую питательными веществами среду). Фернандо Альтамирано приносит коллегам свои извинения за то, что запах смесей из сточных вод часто вынуждал их покидать лабораторию. Выделение фагов может оказаться сложной задачей, и, похоже, Фернандо Альтамирано положил начало тенденции в качестве награды в их исследовательской лаборатории давать фагам имена людей, которые их выделяют. В статье присутствуют изображения фагов øFG02 (Фернандо Альтамирано) и øCO01 (Коди Оливьера).
Рисунок 1 | Бактериофаги в исследовании ученых и их гордые первооткрыватели
Фаг øFG02 и Фернандо Гордилло Альтамирано (слева), фаг øCO01 и Коди Оливьера (справа). Трансмиссионная электронная микрофотография Дениса Корнеева.
Исследователи обнаружили, что открытые ими фаги используют полисахаридные молекулы капсулы A. baumannii в качестве своего основного рецептора. Ученые пришли к такому выводу после наблюдения следующего:
- в попытке избежать киллинга выделенными фагами штаммы A. baumannii эволюционировали в неинкапсулированную форму;
- у этих устойчивых к фагам мутантов были мутации потери функции в генах, ответственных за образование капсулы;
- этот фенотип бактерии был воспроизведен, когда ученые провели нокаут генов из штаммов дикого типа;
- выделенные фаги не могли прикрепиться к этим мутантам.
То, что казалось простым процессом, на самом деле оказалось самым сложным шагом в исследовании. Ученые выявили, что с бактерией A. baumannii сложно проводить генетические манипуляции, а многочисленные попытки трансформации (естественной, химической и электропорацией) оказались безуспешными. Успешные же попытки экспериментов ученые связывают с фактором везения и настойчивостью соавторов Джона Форсайта и Рузин Патва.
Рисунок 2 | Снимки сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) дикого типа (слева) и устойчивого к фагам (справа) Acinetobacter baumannii
Обращает на себя внимание сложная полисахаридная капсула дикого типа, которая отсутствует у устойчивой к фагу бактериальной клетки. Ученые продемонстрировали, что фаги øFG02 и øCO01 используют эту капсулу в качестве рецептора. Не покрытый капсулой, устойчивый к фагам A. baumannii вновь чувствителен к противомикробным препаратам. Фото: Денис Корнеев.
Бактериальная капсула — основной фактор вирулентности A. baumannii, защищающий ее от иммунной системы, снижая проницаемость для антибиотиков [6]. Опираясь на фактические сведения, ученые полагают, что толстая капсула исследуемых штаммов дикого типа также играет роль в их очень низкой степени трансформации. В любом случае, исследователи были взволнованы, узнав, что капсуло-дефицитный, устойчивый к фагам A. baumannii стал повторно чувствительным к системе комплемента человека и пострадал от снижения до минимальных ингибирующих концентраций семи антибиотиков, в первую очередь β-лактамов, но также и миноциклина. Выделенные учеными фаги поставили A. baumannii перед дилеммой: умереть от фага или от антибиотика. Результаты исследования подчеркивают важность для терапии идентификации бактериальных рецепторов, которые используются любым фагами; они также вдохновили ученых на статью о перспективах, в которой они размышляют на эту тему [7].
Только в течение последнего десятилетия среди патогенных штаммов микробов, таких как Pseudomonas aeruginosa [8], Enterococcus faecalis [9], Staphylococcus aureus [10] и Klebsiella pneumoniae [11], было выявлено подобное взаимодействие между механизмами устойчивости к фагам и бактериальной адаптацией. Авторы данной работы добавляют в этот список бактерий A. baumannii, что еще раз подчеркивает многогранный потенциал фаговой терапии в борьбе с антибиотикорезистентностью.
новых рисунков демонстрируют странную красоту фагов-убийц бактерий | Наука
Икосаэдрический вирус с башней Sulfolobus.Бен ДарбиКак вы отмечаете Год Фага? Даже если вы никогда не слышали об этих крошечных вирусах, убивающих бактерии, вы определенно сталкивались с ними.На планете существуют триллионы бактериофагов, или фагов, и подобных вирусов, и во многих местах их даже больше, чем местных бактерий.
Фаги специализируются на заражении бактерий и обмене генами, чтобы они могли использовать своих хозяев для репликации. В своих различных формах фаги в конечном итоге управляют биологическими процессами внутри организма и в экосистемах. Теперь, спустя столетие после их открытия, еще многое предстоит узнать об этих крошечных существах и их заманчивых возможностях — например, как создать искусственно созданные фаговые вирусы, способные уничтожить даже самые устойчивые к лекарствам бактериальные инфекции.
Форест Ровер из Государственного университета Сан-Диего, соавтор книги «Жизнь в нашем мире фагов», объясняет, почему он хочет, чтобы мир отметил 2015 год как Год фага:
Почему сейчас празднуют фаги?
Прошло уже 100 лет, что мы действительно знаем об этих вещах. В зависимости от того, кто именно открыл фаги, первый довольно конкретный пример был в 1915 году. [Открытие обычно приписывают британскому бактериологу Фредерику В. Торту.] И теперь, после реального сокращения числа людей в этой области, я бы сказал, что за последние десять лет или около того произошло возрождение. Люди признают, что эти вещи играют важную роль в экосистемах, микробной диверсификации, обмене генами — повсюду. Так что вы действительно можете принять участие и внести свой вклад в эту область и открыть для себя новые, большие и важные вещи. С точки зрения биолога, это очень весело.
Тот факт, что они настолько распространены, немного сбивает с толку.
В одном миллилитре морской воды содержится примерно 10 миллионов фагов и около 100 миллионов из них в грамме почвы. Они действительно повсюду, практически во всем, что вы можете придумать, и они невероятно разнообразны. Но они всего лишь часть системы. В большинстве случаев они совершенно безвредны для нас. На самом деле они, наверное, по большей части нам помогают.
Чем они занимаются?
Что ж, сравнение зомби правильно для одного поведения.Фаги входят внутрь, и они делают свою ДНК частью ДНК бактерий, и это часто заставляет бактерии делать другие вещи, чем они бы делали в противном случае. Хороший способ подумать о том, как это работает, — представить себе симбиоз самых разных людей, от патогенов до мутуализма. В любой такой системе, на которую вы посмотрите, похоже, что гены, осуществляющие локальную адаптацию, приобретаются путем переноса. В кишечнике человека, например, у вас есть определенный набор бактерий, которые живут с вами, но в течение жизни происходит то, что эти бактерии приобретают гены [от фагов], которые могут быть полезными, вредными или нейтральными для гостья.
Значит, эта подмена ДНК может иметь огромный диапазон результатов?
Право. На самом деле это та область, где фаги иногда могут быть вредными для людей, когда гены, вызывающие заболевание, переносятся фагом. Таким образом, многие патогены существуют только потому, что бактерии, которые обычно не являются патогенами, имеют другие гены, добавленные фагом. Вероятно, самый известный пример — холера, когда они действительно хорошо знают, как фаг вызывает это заболевание. То же самое происходит со многими моделями E.coli , вызывающие пищевое отравление.
А как насчет полезной стороны?
Если вы посмотрите на коралловый риф, вы увидите, что с ним связаны в основном те же типы бактерий. Но потом вы видите, что в разных местах были приобретены разные гены, которые позволяют бактериям адаптироваться к местным условиям. И в этом случае это хорошо, поскольку способствует общему здоровью рифа. Другая сторона просто убивает бактерии, потому что это их продукт питания.Это еще одна важная вещь, которую они делают.
Как это бактериальное убийство может работать для борьбы с болезнями?
Об этом думали 100 лет. Первоначально люди думали, что они нашли волшебную пулю — микробы для уничтожения микробов. Но потом мы начали использовать антибиотики, и по большей части это то, что мы используем до сих пор. Места, где они могут часто использовать фаготерапию, будут в России или Польше. Но есть своего рода движение за их повторное использование в западном мире, особенно потому, что многие бактерии стали устойчивыми к антибиотикам.
Почему у них такой большой потенциал в борьбе с болезнями?
Есть несколько преимуществ. Антибиотики в основном убивают все бактерии или большую их часть, а во многих случаях этого не нужно. Вы не хотите убивать все бактерии в кишечнике каждый раз, когда у вас есть эта инфекция. Вот почему фаги так интересны: они нацелены и охотятся на определенный штамм патогена. Кроме того, один фаг за пару часов превращается в миллион. Антибиотики никогда не усиливаются, вы должны постоянно вводить их в свой организм.Но с фагами, если там есть бактерии-мишени, они будут привлекать больше этих вещей, которые их убивают, на что вы и надеетесь. А затем, когда целевые бактерии исчезнут, исчезнут и фаги, которые ими питаются.
Можем ли мы создать фаги искусственно, чтобы они были нацелены именно на вредные бактерии, которые нам нужны?
Да. Я думаю, что их изоляция от множества различных фагов в природе имеет довольно неприятную историю — иногда это работает, иногда нет — и с нормативной точки зрения это всегда будет немного отрывочным.Я верю, что синтез — это путь, по которому мы будем идти. Мы разрабатываем их довольно давно, с 1970-х годов или, может быть, даже раньше, и мы знаем о них довольно много. Вы можете просто взять определенный фрагмент ДНК, добавить его в пробирку, в которой есть белковые части, из которых состоит фаг, и вы получите из него жизнеспособный фаг. ДНК инициирует создание жизнеспособного фага, так что это действительно своего рода волшебная наномашина.
Звучит идеально, так что задерживают новые препараты для лечения фагов?
Мы тратим сотни миллионов долларов на разработку антибиотика.Пока что действительно не было таких инвестиций, которые потребовались бы для разработки фагов до уровня, на котором большинству из нас было бы удобно их использовать. Если у меня бактериальная инфекция, я все равно буду принимать антибиотики прямо сейчас.
Что нам еще нужно узнать после столетия изучения фагов?
Мы много знаем о некоторых из них, потому что они были инструментами, используемыми для развития молекулярной биологии, выяснения того, как работает ДНК, и действительно научились изучать вещи на молекулярном уровне.Так что в этом случае мы много знаем. Когда дело доходит до того, что происходит в окружающей среде, мы очень широко знаем, что они делают, но о специфике того, что происходит даже в человеческом теле, мы знаем очень мало.
Их генетическое разнообразие, которое по большей части неизвестно, невероятно. В большинстве областей мы можем сказать, что не знаем, что делает конкретный ген, но, по крайней мере, мы видели это раньше. С фагами вы можете попасть в любую среду, которую захотите, и большинство генов, которые они несут, может быть, 80 процентов, мы не только ничего не знаем об этих генах, но мы даже никогда их раньше не видели.На данный момент это только начинающаяся наука, и все время происходят новые открытия. Это одно из тех мест, куда может пойти любой, и вы гарантированно найдете что-то классное.
Изобразительное искусство Здоровье Медицина Микробы, бактерии, вирусыБактериофаг
Для поиска по всей книге введите термин или фразу в форму подПользовательский поиск
Бактериофаг (страница 1)
(В этой главе 2 страницы)
© Кеннет Тодар, доктор философии
Бактериофаги
Вирусы, атакующие бактерии, были обнаружены Twort и d’Herelle в 1915 и 1917 гг.Они заметили, что бульонные культуры некоторых кишечных бактерии могут быть растворены путем добавления фильтрата, не содержащего бактерий получается из сточных вод. Считается, что лизис бактериальных клеток вызванный вирусом, который означал «фильтруемый яд» («вирус» в переводе с латыни означает «яд»).
Вероятно, каждая известная бактерия подвержена заражению одним или несколькими вирусы или «бактериофаги», как их называют (сокращенно «фаг», от Гр.«фагеин» означает «есть» или «грызть»). Большинство исследований было выполнено на фагах, атакующих кишечную палочку, особенно Т-фаги и фаг лямбда.
Как и большинство вирусов, бактериофаги обычно несут только генетические Информация необходимы для репликации их нуклеиновых кислот и синтеза их белковые оболочки. Когда фаги заражают свою клетку-хозяин, порядок бизнес состоит в том, чтобы воспроизвести их нуклеиновую кислоту и произвести защитная белковая оболочка.Но они не могут сделать это в одиночку. Они требуют прекурсоры, выработка энергии и рибосомы, поставляемые их бактериальными клетка-хозяин.
Бактериальные клетки могут заражаться вирусами одного из двух типов. называется литических инфекций и лизогенный (умеренный) инфекции. В E. coli , литические инфекции вызываются группой из семи фагов, известных как Т-фаги, в то время как лизогенные инфекции вызываются фагом лямбда.
Литические инфекции
Т-фаги, T1 — T7 называются литическими фагами, потому что они всегда вызывают лизис и смерть их клетки-хозяина, Бактерия E. coli . Т-фаги содержат в качестве генетического материала двухцепочечную ДНК. В в дополнение к их белковой оболочке или капсиду (также называемый «голова»), Т-фаги также обладают хвостом и некоторыми родственными структурами.А диаграмма и электронная микрофотография бактериофага Т4 показаны ниже. В хвостовая часть включает сердечник, хвостовую оболочку, опорную пластину, хвостовые штифты и хвостовую часть. волокна, все из которых состоят из разных белков. Хвост и родственные структуры бактериофагов обычно участвуют в прикрепление фага и обеспечение проникновения вирусного ядра кислота в клетку-хозяин.
Левый. Электронная микрофотография бактериофага Т4. Верно. Модель фага Т4. В фаг обладает геномом линейной дц ДНК, содержащейся в икосаэдрическая голова. Хвост состоит из полого сердечника, через который ДНК вводится в клетку-хозяин. Волокна хвоста участвуют в распознавание специфических вирусных «рецепторов» на поверхности бактериальной клетки.
Перед вирусной инфекцией клетка участвует в собственной репликации ДНК и транскрипция и перевод собственной генетической информации для переноса вне биосинтеза, рост и деление клеток.После заражения вирусная ДНК берет на себя механизм клетки-хозяина и использует его для производства нуклеиновых кислот и белки, необходимые для производства новых вирусных частиц. Вирусная ДНК заменяет ДНК клетки-хозяина в качестве матрицы для обеих репликаций (чтобы производить больше вирусная ДНК) и транскрипция (для производства вирусной мРНК). Вирусные мРНК затем транслируется с использованием рибосом, тРНК и аминокислот клетки-хозяина в вирусные белки, такие как белки оболочки или хвоста.Процесс ДНК репликация, синтез белков и сборка вирусов — это тщательно продуманные согласованное и рассчитанное по времени мероприятие. Общий процесс литического заражения схематически показано на рисунке ниже. Обсуждение конкретных шагов следует.
The литический цикл бактериального вируса, например бактериофаг Т4.
Первый этап репликации фага в его клетке-хозяине называется адсорбцией .В фаговая частица получает шанс столкновение с химически дополнительным участком на бактериальной поверхности, затем прикрепляется к этому месту с помощью волокон своего хвоста.
После адсорбции фаг вводит свою ДНК в бактериальный клетка. Хвостовая оболочка сжимается, и сердечник проходит сквозь стену. к мембране. Этот процесс называется проникновением и , и это может быть и то, и другое. механический и ферментативный.Фаг Т4 упаковывает кусочек лизоцима в основании его хвоста от предыдущей инфекции и затем использует лизоцим для разрушения части стенки бактериальной клетки для вставки хвостового сердечника. ДНК вводится в периплазму. бактерии, и, как правило, неизвестно, как ДНК проникает мембрана. Проиллюстрированы процессы адсорбции и проникновения. ниже.
Адсорбция, проникновение и введение ДНК бактериофага Т4 в клетку E. coli . Т4 прикрепляется к пориновому белку внешней мембраны, ompC.
Сразу после инъекции вирусной ДНК происходит процесс инициировал синтез под названием ранние белки . Имеется в виду транскрипция и трансляция участка ДНК фага для создания набор белков, необходимых для репликации ДНК фага.Среди произведенные ранние белки являются ферментом восстановления, чтобы восстановить отверстие в стенке бактериальной клетки фермент ДНКаза, который разрушает ДНК хозяина. в предшественников фаговой ДНК и вирусспецифической ДНК-полимеразы, которая будет копировать и реплицировать ДНК фага. В этот период клетки способность генерировать энергию и синтезировать белок поддерживаются, но они были подорваны вирусом.Результат синтез нескольких копий ДНК фага .
Следующий этап — синтез поздних белков. Каждый из несколько реплицированных копий фаговой ДНК теперь можно использовать для транскрипция и трансляция второго набора белков, называемых поздние белки . Поздно белки — это в основном структурные белки, которые составляют капсомеры и различные компоненты хвостового оперения.Лизоцим также является поздним белком, который будет упакован в хвосте фаг и использоваться для побега из клетки-хозяина на последнем этапе процесса репликации.
Тиражируя все их части, следует сборка процесс. Белки, из которых состоят капсомеры, собираются сами в головы и «наматывают» копию ДНК фага. Хвост и вспомогательные структуры собирают и включают немного лизоцима в хвостовая пластина.Вирусы организуют свой побег из клетки-хозяина во время процесс сборки.
Пока вирусы собираются, лизоцим продуцируется как поздний вирусный белок. Часть этого лизозома используется для побега от хозяина. клетки, лизируя пептиодгликан клеточной стенки изнутри. Этот выполняет лизис клетка-хозяин и выпуск зрелый вирусы , которые распространяются на соседние клетки, заражают их и завершают в цикл.Жизненный цикл Т-фага занимает от 25 до 35 минут. полный. Поскольку клетки-хозяева в конечном итоге гибнут в результате лизиса, это Тип вирусной инфекции называется литической инфекцией.
продолжение главы
Следующая страница
Нарисуйте помеченную диаграмму бактериофага 12 класса по биологии CBSE
Подсказка: Вирусы — это микроскопические паразиты и инфекционные агенты с живыми и неживыми характеристиками.Эти вирусы могут заражать растения, животных и другие микроорганизмы. Полный ответ:
Вирусы — это неклеточные, микроскопические и инфекционные агенты, которые живут в зависимости от клетки-хозяина. Они содержат генетический материал в виде РНК или ДНК и белков; они вторгаются и размножаются с помощью организмов, растений и клеточных органелл животных, поскольку им не хватает необходимого клеточного материала.
Определенные вирусы, поражающие бактерии, известны как бактериофаги или фаги, то есть пожиратели бактерий.Бактериофаги — это вирусы, которые паразитируют на них и размножаются внутри них. Вот некоторые из их характеристик:
a) Эти бактериофаги, как и другие вирусы, также состоят из ядра генетического материала, окруженного капсидом.
b) Генетический материал бактериофага может быть ДНК или РНК в зависимости от их общего состава.
c) После заражения бактериальных клеток-хозяев они перехватывают клеточный контроль над клеткой-хозяином и не дают им продуцировать бактериальные компоненты и заставляют их продуцировать вирусные компоненты.
d) Обычно они вызывают лизис бактериальных клеток-хозяев.
Структурный состав бактериофага:
Типичный бактериофаг, состоящий из многогранной головки, короткого воротника и спирального хвоста.
Голова гексагональная и состоит из 2000 капсомеров с генетическим материалом двухцепочечной ДНК или одноцепочечной РНК, присутствующей в голове.
Воротник и усы фага помогают прикрепить шесть длинных хвостовых волокон к частице фага во время сборки вируса.
Хвост имеет цилиндрическую форму и состоит из центральной полой трубки, которая окружена сократительной оболочкой (белком) с кольцевыми кольцами, а дистальный конец хвоста состоит из базальной пластинки с хвостовыми волокнами.
Схема, показывающая структуру бактериофага:
Примечание:
Бактериофаг реплицируется внутри бактериальной клетки с помощью цикла литического или лизогенного цикла. Эти бактериофаги очень специфичны для бактерий-мишеней, а также эффективны против патогенов с множественной устойчивостью.
Криоэлектронная микроскопия структура нитчатого бактериофага IKe
Значение
Нитчатый бактериофаг IKe — один из многих необолочечных бактериальных вирусов, которые инкапсулируют кольцевой одноцепочечный вирусный геном в оболочке капсида фага.Оболочка IKe состоит из примерно 3100 копий основного белка оболочки IKe. Структуры с атомным разрешением нитчатых фагов немногочисленны, а структура одноцепочечной ДНК является предметом дискуссий. Наша криоэлектронная микроскопия структуры нитчатого бактериофага IKe с разрешением 3,4 Å предоставляет атомные детали структуры основного белка оболочки, симметрии оболочки капсида и ключевых взаимодействий, управляющих ее сборкой. Мы предлагаем модель конформации кольцевого одноцепочечного ядра ДНК и взаимодействия между оболочкой капсида и внутренним ядром ДНК.
Abstract
Нитчатый бактериофаг IKe инфицирует клеток Escherichia coli , несущих пили IncN. Мы сообщаем о структуре вирусной частицы IKe, полученной методом криоэлектронной микроскопии, с разрешением 3,4 Å. Главный белок оболочки [белок 8 (p8)] состоит из 47 остатков, которые сворачиваются в спираль длиной ∼68 Å. Построена атомная модель белка оболочки. Пять спиралей p8 в горизонтальном слое образуют пентамер, а симметрично соседние слои p8 образуют правый спиральный цилиндр с подъемом на пентамер 16.77 Å и угол поворота 38,52 °. Внутренняя поверхность цилиндра капсида заряжена положительно и имеет прямое взаимодействие с инкапсулированным кольцевым геномом одноцепочечной ДНК, электронная плотность которого соответствует необычной структуре левой спирали. Подобно структурам капсида других нитчатых вирусов, прочная упаковка капсида в частице IKe поддерживается гидрофобными остатками. Несмотря на различную длину и большие отличия последовательностей от других нитчатых фагов, π – π-взаимодействия были обнаружены между Tyr9 одного p8 и Trp29 соседнего p8 в IKe, которые аналогичны взаимодействиям, наблюдаемым в фаге M13, что позволяет предположить, что, несмотря на расхождение последовательностей, общие структурные особенности сохранены.
Нитчатые бактериофаги (фаги) представляют собой группу бактериальных вирусов без оболочки с уникальной морфологией ∼65–70 Å в диаметре и длиной 800–2000 нм. Нитчатые фаги имеют сходные жизненные циклы, и вирионы, вероятно, имеют сходную организацию, хотя не многие фаговые структуры были охарактеризованы с достаточно высоким разрешением, чтобы поддержать эту гипотезу. Капсидные оболочки фагов представляют собой спиральные массивы белковых молекул, собранные из 2 000-8 000 копий одной основной субъединицы белка оболочки.Точное количество субъединиц зависит от длины генома и от соотношения между количеством нуклеотидов (нуклеотидов) и количеством субъединиц (1, 2). В целом, геном инкапсулированной кольцевой одноцепочечной ДНК (оцДНК) фага состоит из ~ 5000-8000 нуклеотидов, которые кодируют ~ 10 белков, включая основной белок оболочки, четыре второстепенных белка оболочки, присутствующие только в нескольких копиях и прикрепленные к дистальному концу. концы вириона и другие неструктурные белки, которые участвуют в репликации вирусного генома, а также в сборке и секреции вируса (3).
Структура капсида и симметрия нитчатого фага были выявлены в ходе ранних исследований дифракции рентгеновских лучей на волокнах. Основываясь на двух различных дифрактограммах (4), нитчатые фаги были разделены на две группы (5). Одна группа, в которую входят fd, M13, IKe и If1, называемая классом симметрии I, имеет дифракционные картины, соответствующие пятикратной симметрии (что делает основной элемент пентамером) и приблизительно 2 1 осью винта. Базовая пентамерная единица, состоящая из основных белков оболочки, связана со следующей единицей на 16-17 Å при трансляции вдоль оси вириона и на ∼180 ° при вращении вокруг оси вириона (C 5 S ∼2 ).Двумя структурами, представляющими нитчатые фаги класса I, являются структуры мутанта Y21M фага fd (от Tyr21 до Met) с подъемом спирали 16,15 Å и закручиванием спирали 36,00 ° (6), и фага M13, имеющего угол наклона. спиральный подъем 16,60 Å и спиральный поворот 36,40 ° (7). Первая структура основана на дифракции рентгеновских лучей на волокне и ориентированном твердотельном ЯМР, а вторая — на ЯМР с вращением под магическим углом (MAS). В группе симметрии класса II нитчатых фагов, которая включает Pf1, Pf3 и Xf, белки оболочки расположены по спирали с подъемом на мономер примерно 3.00 Å и вращением 66–67 °. Единственная структура с высоким разрешением, которая представляет класс II, была получена для Pf1 с помощью дифракции рентгеновских лучей на волокне (8) и упорядоченного твердотельного ЯМР (9). Консенсусная структура для Pf1 при температуре ниже 10 ° C, уточненная по отношению к обоим методам (10), имеет спиральное закручивание 65,90 ° и подъем на субъединицу 3,05 Å. Высокотемпературная форма Pf1 имеет спиральную закрутку 66,70 ° и подъем 2,90 Å. Такое расположение, вероятно, похоже на другие фаги класса II [например.g., Pf3 (11)], но могут иметь небольшие вариации.
Геномы нитчатых фагов имеют круглую форму, начиная с одного конца нити, переходя к противоположному концу и снова поворачиваясь назад. Поскольку геном одноцепочечный, две противоположные цепи не обладают значительным потенциалом спаривания оснований Watson – Crick (12, 13). Подробная информация о структуре оцДНК в нитчатых фагах была получена с использованием различных методик. С помощью совмещенных исследований твердотельного ЯМР было установлено, что фосфатные связи (углы O – P – O) неупорядочены в fd, но упорядочены в Pf1 (14).Измерения сахарной складки в fd методом MAS ЯМР указывают на конформацию C2′-эндо (15), тогда как спектроскопия комбинационного рассеяния предполагает, что дезоксигуанозины являются C3′-эндо, а дексоитимидины могут иметь любую структуру (16). Направленность структуры ДНК в различных нитчатых фагах была определена косвенно путем измерения кругового дихроизма титрованных серебром частиц. Спектр ДНК фага, сходный со спектром двухцепочечной B-ДНК, указывает на правостороннюю спираль в fd, Xf и IKe с расположением оснований и фосфатов (17, 18).
Настоящее исследование раскрывает структуру нитчатого фага IKe класса I, который инфицирует клеток Escherichia coli , несущих N-конъюгативные пили (N-пили) (19). Вирусный геном дикого типа имеет ~ 6880 нуклеотидов и кодирует 10 белков. Подобно другим нитчатым фагам, кодируемый белок 3 (p3) необходим для распознавания клеткой-хозяином и проникновения вируса, поскольку он связывается с втягивающимся ворсом и рецептором TolA клетки-хозяина через два своих функциональных домена D1 и D2 соответственно (20). .При инфицировании основной белок капсида встраивается в мембрану клетки-хозяина, изменяя при этом ее конформацию (21), и геном высвобождается в цитоплазму клетки-хозяина. Геном вирусной оцДНК IKe, как и других нитчатых фагов, затем превращается в двухцепочечную ДНК и реплицируется по типу катящегося круга (3). Реплицированный геном образует удлиненный нуклеопротеиновый комплекс с вирусным белком сборки-репликации [белок 5 (p5)] (22). Нуклеопротеиновый комплекс перемещается близко к клеточной мембране, где p5 заменяется основным белком оболочки [белок 8 (p8)], который предварительно вставляется в мембрану после синтеза (23).Минорные белки оболочки 9 (p9) и 7 (p7) прикрепляются к кончику филамента, чтобы опосредовать секрецию вириона из клеток-хозяев, не убивая клетки (24).
Были получены дифрактограммы волокон фага IKe, и, хотя полная атомная структура не была депонирована, сообщалось, что IKe имеет каноническую симметрию C 5 S ∼2 , аналогичную другим фагам класса I (25 ). Как было показано в исследованиях M13, для эффективной упаковки генома оцДНК требуется минимальный набор боковых цепей (26), однако любая аминокислотная замена в капсидном белке может повлиять на сборку капсида на атомном уровне.Было показано, что структуры M13 и fd-Y21M, которые отличаются только двумя аминокислотами на белке оболочки, имеют разные симметрии и параметры вращения (7). Выравнивание BLAST основных белков оболочки IKe и fd показывает 47% идентичности последовательностей, а их длины отличаются на три аминокислоты. Поэтому мы решили выяснить структуру IKe с высоким разрешением с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), чтобы изучить различия и сходства фагов класса I.
Здесь мы сообщаем об атомной модели капсида интактного нитчатого бактериофага IKe, которая была построена на основе вычисленных 3.Карта электронной плотности с разрешением 4 Å. Кроме того, асимметричная реконструкция вириона показала, что геном оцДНК, инкапсулированный в частицу, принимает структуру левой спирали. Два из четырех положительно заряженных остатков на С-конце главного капсидного белка тесно взаимодействуют с внутренней структурой ядра ДНК и стабилизируют ее.
Результаты
Определение структуры оболочки капсида IKe.
Мы приготовили застеклованный образец крио-ЭМ фага IKe и проанализировали его с помощью крио-ЭМ ( SI Приложение , рис.S1 A и B ). Начальные параметры спирали были адаптированы из крио-ЭМ модели низкого разрешения бактериофага fd (27) (закрутка 37,40 °; подъем 17,40 Å). Параметры спирали были уточнены до 38,52 ° для винтовой закрутки и 16,77 Å для подъема по спирали с помощью Relion2 (28) ( SI Приложение , рис. S2 A ). Окончательная реконструкция, рассчитанная с применением пятикратной и спиральной симметрии, имела общее разрешение 3,4 Å, и было использовано 112 808 выбранных сегментов из 253 156 сегментов в рамке ( SI Приложение , рис.S1 C — E , S2 B и S3 A и таблица S1). Плотность внутреннего ядра ДНК была размыта из-за несоответствия симметрии между капсидом и ядром ДНК (рис. 1 A ).
Рис. 1.Строение нитчатого фага IKe. ( A ) Лента и схемы с затемненной поверхностью, показывающие крио-ЭМ структуру нитчатого фага IKe. Спиральная оболочка капсида полупрозрачна и окрашена в белый цвет. Внутреннее размазанное ядро ДНК окрашено в красный цвет.(Масштабная шкала, 5 нм) ( B , Top ) Схематическая диаграмма, показывающая полипептидную цепь основного белка оболочки IKe p8. ( B , Bottom ) Ленточные диаграммы, показывающие основу структуры одного мономера p8. H N и H C для p8 окрашены в фиолетовый и зеленый цвета соответственно. Угол между H C и осью вириона и угол поворота между H N и H C были измерены, и значения показаны на схематических диаграммах.( C ) Лента и схемы с затенением поверхности, показывающие гидрофобные и гидрофильные остатки H N ( слева , положение 1 на A ) и четыре положительно заряженных остатка H C ( справа , положение 2 на A ). Боковые цепи гидрофобных, положительно заряженных и отрицательно заряженных остатков показаны и окрашены в оранжевый, синий и красный цвета соответственно. Из изображения видно тесное взаимодействие с ДНК положительно заряженных R43 и K51.
Структура основного белка оболочки.
Предшественник основного белка оболочки IKe p8 содержит 82 аминокислоты; первые 29 N-концевых остатков действуют как сигнальный пептид (29). Сигнальный пептид помогает закрепить белок-предшественник p8 на клеточной мембране, а предшественник расщепляется во время сборки вируса лидерной пептидазой бактерий (30), оставляя 53 остатка на С-конце для образования спиральной оболочки капсида. 47 из этих 53 остатков (остатки 7–53) были распознаны на рассчитанной крио-ЭМ карте и были построены в окончательной атомной модели ( SI Приложение , рис.S1 E ). Плотность вокруг отсутствующих шести N-концевых остатков p8 нарушена, вероятно, из-за динамики, наблюдаемой в других вирусах нитчатых фагов (31).
В целом, p8 принимает удлиненную правостороннюю α-спиральную структуру (рис. 1 B ). Изгиб, внесенный остатком Pro30 в середине спирали, делит спираль длиной 68 Å на две части, H N и H C (рис. 1 B ). Длинная спираль изгибается посередине с дистальным концом H C вблизи вирусной оси, а дистальный конец H N проходит от вирусной оси.Угол поворота между H N и H C составляет ∼22 ° (рис. 1 B ). H N содержит 10 гидрофобных остатков и четыре заряженных остатка (Glu12, Asp15, Lys18 и Asp23). 10 гидрофобных остатков расположены с одной стороны от H N и скрыты на границах контакта с соседними субъединицами белка. Четыре заряженных остатка расположены на стороне H N , которая полностью обнажена на внешней поверхности вириона (рис. 1 C ).H C включает 14 гидрофобных остатков и четыре положительно заряженных остатка. C-концевой дистальный конец H C полностью скрыт и имеет четыре положительно заряженных остатка, открытых на внутренней поверхности оболочки капсида. Два из них указывают на инкапсулированную ДНК (рис. 1 C ).
Сборка оболочки капсида.
Молекулы p8 собираются, образуя правые спирали в симметричной цилиндрической оболочке, имеющей внешний диаметр 64 Å (исключая неупорядоченный N-конец) и внутренний диаметр около 22 Å (рис.2 A и B ). Пять молекул p8 (рис.2 B , позиции 1, 2, 3, 4 и 5) симметрично распределены вокруг вирусной оси, образуя пентамерный белковый слой, связанный с пятью молекулами p8 верхнего соседнего слоя ( 2 B , позиции 1 ‘, 2’, 3 ‘, 4’ и 5 ‘) за счет смещения на 16,77 Å вдоль и поворота на 38,52 ° вокруг длинной оси вируса (рис. 2 B ) . Молекула p8 длиной 68 Å в положении 1 слоя пентамерного белка n ( n P1) взаимодействует с дополнительными тремя слоями пентамерного белка в каждом направлении: ее N-концевой дистальный конец покрывает дистальный конец H C из n + 3 P1 ′ и n + 2 P1 (рис.2 A , часть 1), его центральная часть взаимодействует с дистальными концами H N n -1 P5 ′ и H C n + 1 P1 ′ (рис.2 A , часть 2), а его С-концевой участок взаимодействует с частями H N n -2 P1 и n -3 P5 ′ (рис. 2 A , часть 3). С-концевые части молекул n + 1 p8 и N-концевые части молекул n -1 p8 заполняют промежутки между пятью молекулами p8 пентамерного белкового слоя n (рис.2 А ).
Рис. 2.Винтовая сборка капсида IKe. ( A , слева ) Ленточная диаграмма, показывающая фрагмент капсида IKe из семи слоев пентамерного белка ( n + 3, n + 2, n + 1, n , n — 1, n — 2, n — 3) разных цветов. ( A , справа ) Ленточные и стержневые диаграммы пронумерованных областей в рамке на панели Left , показывающие взаимодействия одного мономера p8 ( n P1, оранжевого цвета) с соседними субъединицами.Основные белки оболочки из одного и того же пентамерного белкового слоя окрашены одинаково. ( B ) Ленточные и поверхностные затененные диаграммы, показывающие вид сбоку (, слева, ) и сверху (, справа, ) двух пентамерных белковых слоев и их взаимосвязь с помощью операторов спиральной симметрии. ( C ) Поверхностный электростатический потенциал спиральной оболочки p8. Отрицательный и положительный электростатические потенциалы окрашены в красный и синий цвета соответственно.
Взаимодействия между молекулами опосредуются в основном гидрофобными остатками, которые высоко консервативны среди нитчатых фагов (рис.3). Из этих консервативных остатков мутационные и структурные исследования показали, что в фаге Ff (общее название семейства трех почти идентичных фагов M13, fd и f1) единственное ароматическое кольцо Trp26 контактирует с соседними гидрофобными остатками, чтобы играть критическую роль в сборка капсида (7, 32). В сборке капсидного белка IKe ароматическое кольцо Trp29 образует π – π взаимодействие с ароматическим кольцом остатка Tyr9 из соседней молекулы (Fig. 2 A ). Остаток Tyr9 не консервативен у других нитчатых бактериофагов (рис.3). Однако в M13 ароматическое кольцо Trp26 взаимодействует с Pro6 аналогично взаимодействию Trp29 с Tyr9, а Trp26 M13 имеет дополнительные контакты с двумя другими гидрофобными остатками, Ala7 и Ile39 (7, 32). Известно, что такие пролин-ароматические взаимодействия стабилизируют структуры многих белков (33). Взаимодействие между ароматическим кольцом Trp29 и кольцом Phe45 в IKe геометрически подобно соответствующему взаимодействию Trp26 – Phe42 в M13 (7, 32). Как мы наблюдали для M13, наложение ароматических колец в IKe может дополнительно улучшить упаковку и стабильность оболочки капсида.
Рис. 3.Выравнивание последовательностей трех основных белков оболочки нитчатых бактериофагов. ( Top ) Выравнивание последовательностей основных белков оболочки IKe, If1 и fd. Вторичная структура показана над трассами. Полностью консервативные остатки показаны белым на красном фоне. Консервированные остатки заключены в рамку. Полностью консервативные гидрофобные остатки с короткими боковыми цепями, ароматические остатки, положительно заряженные остатки, отрицательно заряженные остатки и полярные остатки отмечены оранжевыми кружками, оранжевыми кубиками, синими треугольниками, красными треугольниками и пурпурными звездами соответственно.( Bottom ) Стерео ленточные диаграммы, показывающие положения полностью консервативных остатков в структуре IKe p8. Консервированные остатки представлены шариками, окрашенными, как описано в легенде для панели Top .
Помимо гидрофобных взаимодействий, две межмолекулярные водородные связи между субъединицами дополнительно стабилизируют архитектуру оболочки капсида (Nζ n P1 Lys46 до O n + 1 P5 ‘Lys51, 2,8 Å; N ζ n P1 Lys46 до O из n + 1 P5 ′ Val53, 2.6 Å). Внешняя поверхность оболочки капсида IKe в основном нейтральна и редко украшена отрицательно и положительно заряженными остатками, тогда как внутренняя поверхность в основном состоит из положительно заряженных остатков (рис. 2 C ). Боковые цепи Arg43 и Lys51 указывают на внутренний просвет оболочки и опосредуют взаимодействия с внутренним ядром ДНК (рис. 1 C и SI, приложение , рис. S4), и боковыми цепями Lys46 и Lys47. указывайте больше в сторону. Интересно, что в IKe концевой лизин (Lys51) играет важную роль в связывании ДНК, но может быть заменен на аланин в M13 (26).
Структурные сравнения с другими нитчатыми бактериофагами.
Структурные сравнения основных белков оболочки нитчатых бактериофагов показывают, что структура IKe p8 очень похожа на структуру M13, несмотря на большие отклонения в последовательности и разницу в длине, что в первую очередь связано с более длинной N-концевой областью IKe. Наложение структуры одной субъединицы p8 из IKe с субъединицей M13 (запись PDB 2MJZ) показывает среднее среднеквадратичное отклонение (rmsd), равное 1.1 Å между выровненными атомами Cα (остатки 8–53 IKe p8 сравнивали с остатками 5–50 трех лучших моделей ЯМР M13 p8; индивидуальные среднеквадратичные значения 1,2, 1,3 и 0,9 Å). Основное структурное различие было вызвано Pro30 из IKe p8, который вносит излом в спираль и приводит к большему углу поворота между H N и H C основного белка оболочки IKe по сравнению с M13 (22,1 ° против 13,5 °) (рис.4). Интересно, что в IKe несколько ключевых остатков, например, W26, I42, F45 и F48, позволяют ему упаковываться аналогично другим фагам класса I, регулируя его симметрию.Таким образом, в настоящее время очень немногие структурно охарактеризованные представители группы I класса различия заключаются в основном в их спиральных параметрах. Недавно определенная структура нитчатого фага M13 (запись PDB 2MJZ) показала поворот на 36,40 ° и подъем на 16,60 Å (7), а fd-Y21M (запись 2C0X в PDB) имеет расположение капсида с поворотом на 36,00 ° и подъемом на 16,20 °. Å (6) (рис.4). Из трех, IKe имеет самый большой угол поворота 38,52 °, что, вероятно, является следствием большого угла поворота между H N и H C IKe p8 и его немного более длинной последовательностью.
Рис. 4.Структурные сравнения основных белков оболочки фагов IKe, M13 класса I и мутанта fd-Y21M. ( Left ) Структурные наложения основного белка оболочки IKe (красный) с белком M13 (запись PDB 2MJZ, синий) на основе областей H C . ( Right ) Структурные наложения основного белка оболочки IKe (красный) с белком мутанта фага fd Y21M (запись PDB 2C0X, зеленый) на основе областей H C . Параметры спирали приведены для каждой структуры фага.
Структура внутреннего ядра ДНК.
Для определения структуры внутреннего ядра ДНК из изображений вычитали плотности оболочки капсида и выполняли асимметричную реконструкцию с изображениями без оболочки капсида, как описано ранее (34). Предполагая фиксированную взаимосвязь между капсидом и внутренней оцДНК, ориентация внутренней оцДНК должна быть одним из пяти связанных с симметрией эквивалентных положений оболочки капсида (34). Таким образом, для каждой частицы генерировалось пять связанных с симметрией эквивалентных ориентаций оболочки капсида (C5 расширен до C1, C5 – C1).Ориентации внутренней оцДНК были определены с помощью трехмерной классификации с использованием Relion2, выполненной с эквивалентными ориентациями без выполнения ab initio поисков ориентации частиц ( SI Приложение , рис. S3 B ). Результаты классификации показали четкую спиральную структуру внутренней оболочки для некоторых классов. Дальнейший анализ показал, что спиральные структуры разных классов эквивалентны и связаны друг с другом поворотом вдоль винтовой оси на 72 ° ( SI Приложение , рис.S3 B ).
Затем было выполнено моделирование с использованием модели структуры капсида и случайно сгенерированного внутреннего спирального объекта (мы выбрали обычную B-ДНК), который находился либо в фиксированном, либо в нефиксированном положении относительно капсида ( SI Приложение , рис. S5). ). Результаты моделирования показали, что внутренняя спиральная структура может быть получена только тогда, когда спиральный объект находится в фиксированном положении по отношению к капсиду ( SI Приложение , рис. S5 A и B ).Это согласуется с предыдущими исследованиями асимметричной реконструкции для объектов со смешанной симметрией (34⇓ – 36). Кроме того, результаты показали, что относительное вращение внутренней спиральной структуры между различными классами было результатом неправильно назначенного угла азимутального угла, который отличается от реального значения на n × 72 ° для большинства частиц одного класса ( n — константа для каждого класса) ( SI Приложение , рис. S3 B и S5 A ).
Частицы в одном из классов были отобраны по их значениям максимального правдоподобия, а ориентации, определенные для внутреннего ядра оцДНК, использовались для окончательной асимметричной реконструкции либо с исходными необработанными изображениями (рис.5 A , слева ) или изображения с вычитанием капсида (рис. 5 A , справа и SI, приложение , рис. S3 B ). Реконструкция частиц также была выполнена без наложения какой-либо симметрии (реконструкции C1; SI Приложение , рис. S6 A и B ). И капсид, и ядро оцДНК наблюдались на полученной карте реконструкции C1, хотя разрешение карты ниже, чем разрешение асимметричной реконструкции C5 – C1 (ориентация получена из симметричных реконструкций) ( SI Приложение , рис.S6 A и B ), дополнительно подтверждая фиксированную взаимосвязь между капсидом и ядром оцДНК.
Рис. 5.Структура внутреннего ядра оцДНК. ( A , Left ) Схема с затененной лентой и поверхностью, показывающая асимметричную реконструкцию IKe нитчатого бактериофага, рассчитанную по исходным необработанным изображениям с ориентациями, определенными для внутреннего ядра ДНК. Спиральная оболочка окрашена в белый цвет, а плотность ядра ДНК, очерченная на уровне 17 σ, прозрачна и окрашена в розовый цвет.Плотность ядра ДНК, выделенная на уровне 26 σ, окрашена в красный цвет. Модель капсида помещена на карту. ( Средний и Правый ) Поверхностная затененная диаграмма, показывающая спиральные особенности внутреннего ядра ДНК и левой спирали. Шаг левой спирали внутреннего ядра ДНК составляет ∼34 Å. ( B ) Лента и схемы с затенением поверхности, показывающие тонкие срезы вируса. Взаимодействия между оболочкой капсида и внутренним ядром ДНК в основном опосредуются остатками Lys51 и Arg43.Остатки Arg43, вероятно, контактируют с остовом ДНК. Плотность оболочек прозрачная и окрашенная, как описано в A . Структура оболочки капсида IKe окрашена в оранжевый цвет.
Окончательная карта асимметричной реконструкции ясно показала, что оцДНК принимает левостороннюю спиральную структуру (рис. 5 A ). Диаметр этой спирали на уровне 17 σ составляет ∼19 Å. Шаг реконструированной структуры составляет ∼34 Å (рис. 5 A ), что примерно вдвое превышает подъем слоя капсидного белка.Поскольку не ожидается, что оцДНК будет демонстрировать значимое спаривание оснований, она, скорее всего, стабилизируется за счет асимметричных взаимодействий (соотношение нуклеотид-белковая субъединица составляет ~ 2,4) с оболочкой капсида через боковые цепи двух положительно заряженных остатков (Arg43 и Lys51). (Рис. 5 B и SI Приложение , Рис. S4). Эти электростатические взаимодействия должны играть важную роль в поддержании стабильной конформации ядра оцДНК. В соответствии с смоделированной структурой ядра оцДНК, анализ спектра мощности усредненных по классам изображений показал пик около R = 0.06 Å −1 линии слоя 1/34 Å −1 ( SI Приложение , рис. S6 D и S7).
Центральные участки спирали оцДНК показали два отдельных пика, что свидетельствует о том, что две цепи ДНК обращены друг к другу, как в двухцепочечных структурах ДНК ( SI Приложение , рис. S6 C ). Однако разрешение внутреннего ядра ДНК недостаточно высоко, чтобы позволить нам построить модель ДНК с атомным разрешением на данном этапе.
Резюме и обсуждение
Два основных класса симметрии, которые описывают капсидную организацию нитчатых бактериофагов, были идентифицированы исследованиями дифракции рентгеновских лучей на волокнах, и IKe принадлежит к группе симметрии класса I.Для этого класса капсид организован в виде спирального расположения симметричных пентамеров, каждый из которых состоит из пяти симметрично связанных и эквивалентных субъединиц белка оболочки, с поворотом и подъемом в зависимости от фага. По сравнению с капсидными структурами фагов класса I M13 и fd-Y21M, IKe имеет больший угол закручивания между последовательными пентамерами, вероятно, в результате большей длины основного белка капсида и присутствия Pro30, который вносит большую кривизну в спираль. В каждой из структур класса I структура капсида поддерживается сильными гидрофобными взаимодействиями (рис.2 А ).
Структура оцДНК в вирусной частице фага является предметом дискуссий. Подобно fd и M13 (1, 7) отношение нуклеотидов к субъединицам IKe нецелое (∼2.4). Спаривание оснований предположительно является редким из-за природы оцДНК, и ранее было показано, что фосфаты неупорядочены (14). Попытки разгадать структуру ДНК были косвенными. Например, очень раннее исследование дифракции волокна на fd указывало на «линии слабого слоя при… 26.7 Å », что, как предполагалось, является шагом спирали ДНК, и не исключено Z-ДНК-подобное расположение спиралей (37). Однако в более позднем исследовании M13 таких отражений не наблюдалось (38). Спектроскопия кругового дихроизма была использована для изучения фагов класса I IKe, fd и If1. Сходство спектров фага fd, ДНК, выделенной из fd, и B-ДНК в ответ на титрование серебром приводит к гипотезе о том, что геном фага принимает структуру правой спирали (18). Недавние исследования ЯМР фага fd подтвердили сильные электростатические взаимодействия между положительно заряженными остатками на С-конце основного белка оболочки и отрицательно заряженными фосфатными остовами генома оцДНК (12).С другой стороны, исследования бактериофага Pf1 методом ЯМР, дифракции рентгеновских лучей и поляризованного комбинационного рассеяния показали, что геном оцДНК Pf1 может образовывать необычную вытянутую конформацию (13, 39), аналогичную структуре ДНК, подобной Полингу. (P-ДНК) (40).
Из предыдущих исследований было ясно, что структура генома нитчатого фага уникальна и что оцДНК может принимать конформации, не относящиеся к B-форме. Из ограниченного разрешения, которое мы получили из данных крио-ЭМ и из тщательного анализа карт электронной плотности, мы пришли к выводу, что оцДНК бактериофага IKe принимает неожиданную левостороннюю спиральную структуру, которая напоминает двухцепочечную спираль, но не имеет спаривания оснований. .Геном оцДНК IKe представляет собой кольцевую ДНК. Двухцепочечная структура, вероятно, образуется, когда геном упакован в оболочку капсида. Однако, в отличие от двойной спиральной структуры геномной ДНК, которая поддерживается спариванием оснований Уотсона-Крика, две цепи оцДНК IKe удерживаются вместе за счет взаимодействий с капсидными белками (рис. 1 C и 2 C ). , и SI Приложение , рис. S4).
Левосторонняя спиральная структура ядра ДНК генома IKe не должна быть полной неожиданностью.Во время сборки вириона вновь реплицированный вирусный геном образует комплекс с вирусным белком репликации-сборки p5. Ранние измерения с помощью электронного микроскопа показали, что комплекс оцДНК-p5 принимает левую конформацию с диаметром около 80 Å (41⇓ – 43). Кроме того, исследования кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии показали, что левосторонний нуклеопротеидный комплекс может собираться при различных стехиометриях p5, в зависимости от длины генома, и сохраняется независимо от методов получения (44, 45).Белки p5 в нуклеопротеиновом комплексе заменяются на p8 во время секреции вируса с клеточной мембраны, и было бы разумно, чтобы геном оцДНК оставался в левой спиральной конформации, поскольку для перехода конформации требуется дополнительная энергия. Спираль оцДНК может претерпевать небольшие конформационные изменения при замене p5 основным белком оболочки p8, но не изменением направленности. Поскольку структура полноразмерного нуклеопротеинового комплекса p5-ssDNA с высоким разрешением недоступна, точная конформация димера p5, характер взаимодействия между белком и ssDNA и их связь с интактной структурой фага требуют дальнейшего изучения.
Экспериментальные процедуры
Подготовка образцов.
Мы получили от профессора Марджори Рассел (Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк) исходные запасы гибридного фага, fIKe, в котором p2 дикого типа был заменен на p2, происходящий из фага f1, что позволило получить значительно более высокие урожаи ( 46). Протокол приготовления фага основан на предыдущих отчетах (47) и подробно описан в SI Приложение , Материалы и методы .
Подготовка крио-ЭМ сетки и сбор данных.
Образцы IKe застекловывали на сетках Quantifoil размером 200 меш (размер отверстия 1,2 мкм) с использованием Vitrobot Mark III (FEI Company). Крио-ЭМ данные бактериофага IKe были собраны вручную в виде стопки кадров фильма при номинальном увеличении 22500 (эффективный размер пикселя 1,32 Å) на электронном микроскопе FEI Titan Krios, работающем при 300 кВ и оснащенном камерой K2 Summit (Gatan ). Подробная информация о подготовке крио-ЭМ сетки и сборе данных представлена в Приложении SI , Материалы и методы .
Обработка изображений.
Анализ данных выполнялся в соответствии с обычной процедурой спиральной реконструкции Relion2 (28). Параметры спирали из PDB модели 2HI5 фага fd (закрутка 37,40 °; подъем 17,40 Å) были использованы для начальной обработки данных. Окончательные уточненные параметры спирали составили 38,52 ° для закрутки и 16,77 Å для подъема. Подмножество данных, состоящее из 112 808 сегментированных частиц, было использовано в окончательной симметричной реконструкции. Окончательное разрешение всего сегмента — 3.4 Å после постобработки ( SI Приложение , рис. S1 и S2 B ). Чтобы определить структуру внутреннего ядра ДНК, были выполнены асимметричные реконструкции IKe, предполагая фиксированную взаимосвязь между капсидом и ДНК с ориентацией частиц, определенной в пятисимметричной реконструкции (от C5 до C1). В качестве альтернативы, частицы, используемые при реконструкции оболочки, были подвергнуты реконструкции с использованием Relion2 без наложения какой-либо симметрии (C1). Подробная информация о процедурах реконструкции приведена в SI Приложение , Материалы и методы .
Благодарности
Мы благодарим Jingren Zhang, Jianlin Lei и Nieng Yan за их поддержку. Мы благодарим Крио-ЭМ и вычислительные платформы отделения Национального центра белковых наук (Пекин) Университета Цинхуа за поддержку. Мы благодарим доктора Мэтью Крэддока за внимательное чтение рукописи. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и технологий Китая (грант 2016YFA0501100), Национального фонда естественных наук Китая (гранты 31861143027 и 31470721), Программы 973 (грант 2015CB2), Китайской программы «Тысячи талантов» для молодых людей. Совместного инновационного центра диагностики и лечения инфекционных заболеваний и Пекинского инновационного центра структурной биологии (Ю.ИКС.). Это исследование было дополнительно поддержано совместным грантом 2423/18 Фонда естественных наук Китайско-израильского научного фонда (предоставлен Y.X. и A.G.).
Сноски
Авторы: A.G. и Y.X. спланированное исследование; J.X. провел исследование; N.D. предоставил новые реагенты / аналитические инструменты; J.X., A.G. и Y.X. проанализированные данные; и J.X., A.G. и Y.X. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямую публикацию PNAS.
Размещение данных: координаты атомов и структурные факторы были депонированы в банке данных белков, www.wwpdb.org (код PDB ID 6A7F), и в банке данных электронной микроскопии, www.ebi.ac.uk/pdbe / emdb / (коды EMDB ID EMD-6993 и EMD-6994).
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1811929116/-/DCSupplemental.
- Авторские права © 2019 Автор (ы). Опубликовано PNAS.
Агенты болезней и лечения
Посредством июньского изображения в нашем календаре на 2019 год мы хотели бы представить вам самое многочисленное существо в мире, которое не живое и даже не мертвое, но ответственное за миллиарды (бактериальных) смертей на протяжении тысячелетий — бактериофаг.
Бактериофаги повсюду. Их можно найти везде, где есть бактерии; в почве, глубоко под земной корой, внутри растений и животных и даже в океанах. Они также живут внутри нас как часть нашей собственной микробиоты.Обычно они не вызывают у нас никаких проблем, но некоторые бактерии могут вызывать заболевание только в том случае, если сами заражены бактериофагом.
Бактериофаг — это вирус, который атакует и убивает бактерии, используя бактерии для репликации своего генома. Они бывают разных форм и размеров, но тот, что на нашем изображении, относится к семейству миовирусов, часто то, что мы представляем, когда думаем о бактериофаге. Когда бактериофаг, подобный этому, находит своего хозяина (обычно это конкретный вид бактерий и / или некоторых из своих очень близких родственников), он соединяет свои хвостовые волокна с рецепторами на бактериальной поверхности и использует своего рода шприц-механизм, чтобы проколоть поверхность бактерии.Затем он вводит свою генетическую информацию в цитоплазму бактерий. Эта генетическая информация копируется, и гены бактериофагов экспрессируются для образования белков, некоторые из которых собираются в капсиды (головы). Капсиды наполнены новым генетическим материалом, чтобы образовалось множество новых бактериофагов.
Хотя на момент написания, в PDB нет структуры целого миовируса, но есть структуры капсидов, частей хвостовых волокон и опорной пластины, к которой эти волокна прикреплены.Капсид и базовая пластина бактериофага Т4, который заражает E.coli , показаны ниже.
Капсид и базовая пластина из фага Т4 (записи PDB 5vf3 и 5iv5).
Капсиды бактериофагов часто бывают икосаэдрическими, имеющими 20 граней и 30 ребер. Размер капсида и количество белков, образующих его, сильно различаются у разных видов бактериофагов. Ниже приведены несколько примеров.
Набор вирусных капидов.В центре находится T4, запись PDB 5vf3, а вокруг нее по часовой стрелке сверху: бактериофаг Caulobacter 5, запись PDB 2w4z. Phi6, запись PDB 5муу. Бактериофаг MS2, запись PDB 2wbh. Вирус Haloarcula hispanica Sh2, запись PDB 6qt9. Бактериофаг альфа3, запись PDB 1m06. Фаг Bordetella BPP-1, запись PDB 3j4u. Запись PDB 2bpa. и батериофаг PM2, запись PDB 2w0c.
лизировать или не лизировать?
Некоторые бактериофаги могут воспроизводиться только через литический жизненный цикл, в котором, помимо репликации, они производят фермент эндолизин.Эндолизин проделывает дыры в клеточной стенке, что приводит к взрыву бактерии. Разрыв клеток (лизис клеток) высвобождает сотни новых бактериофагов, которые могут инфицировать и убивать другие бактериальные клетки-хозяева поблизости. Другие бактериофаги могут чередовать литический жизненный цикл и лизогенный жизненный цикл. В лизогенном цикле бактериофаг не убивает хозяина сразу, а вместо этого копируется вместе с генетической информацией хозяина каждый раз при делении клетки. При правильных условиях вирусный геном может быть активирован, переключившись на литический цикл и произведя сотни новых бактериофагов.
Бактериофаги были открыты более чем за десять лет до пенициллина и успешно использовались для лечения дизентерии и холеры. Несмотря на этот успех, использование бактериофагов в терапевтических целях было омрачено более поздним открытием антибиотиков, которые мы используем уже около ста лет. За это время (в основном из-за чрезмерного и неправильного использования) бактерии эволюционировали и приобрели устойчивость к антибиотикам. По оценкам Организации Объединенных Наций, к 2050 году от инфекций, устойчивых к антибиотикам, умрет больше людей, чем в настоящее время умирает от рака.Уже существуют бактериальные штаммы (известные как супербактерии), устойчивые к большинству широко используемых сегодня антибиотиков. Если вы инфицированы одним из этих организмов, прогноз неутешительный, и вы просто надеетесь, что ваша иммунная система сможет контролировать инфекцию. Но давайте на время забудем об этих ужасных сценариях и сосредоточимся на потенциале бактериофагов, которые могут быть использованы в качестве лекарства.
Бактериофаги в постантибиотическом мире
После увеличения случаев устойчивости бактерий к антибиотикам за последние десятилетия, бактериофаги снова появились в качестве потенциальных альтернативных или дополнительных методов лечения бактериальных инфекций.Желание использовать бактериофаги в качестве терапевтических средств для человека привело к более глубоким исследованиям в западных странах. В настоящее время в ЕС или США нет препаратов для лечения бактериофагов, одобренных для использования человеком, хотя есть штаты (Грузия, Польша), где использование бактериофагов природного происхождения в медицине имеет спорную историю. Некоторые типы бактериофагов были одобрены и используются в пищевой промышленности для уничтожения вирулентных патогенов пищевого происхождения. Несмотря на это, очень мало известно о взаимодействиях между бактериофагом, бактериями и человеком, которым бактерия может заразить.По-прежнему необходимы исследования, чтобы увидеть, насколько безопасны и эффективны бактериофаги. Что наиболее важно, необходимо понять иммунный ответ, который может вызвать незаконный бактериофаг. И кто знает, может быть, однажды они станут нашей первой линией защиты от «супербактерий».
О произведении искусства
Бактериофаг был нарисован К. Принсом из колледжа Импингтон-Виллидж в Кембридже. Он сформирован по форме напоминающих персонажей в игре Minecraft. Благодаря его милому сварливому «лицу» рисунок стал одним из наших любимых.
Romana Gáborová
Лаборатория 11: Вирусы — Бактериофаги
ОБСУЖДЕНИЕ
Вирусы — это инфекционные агенты, имеющие как живые, так и неживые характеристики.
1. Живые характеристики вирусов
- Они размножаются с фантастической скоростью, но только в живых клетках-хозяевах.
- Они могут мутировать.
2. Неживые характеристики вирусов
- Они бесклеточные, то есть не содержат цитоплазмы или клеточных органелл.
- Они не осуществляют метаболизм сами по себе и должны воспроизводиться с помощью метаболического механизма клетки-хозяина. Другими словами, вирусы не растут и не делятся. Вместо этого в инфицированной клетке-хозяине синтезируются и собираются новые вирусные компоненты.
- За немногими исключениями, они обладают ДНК или РНК, но никогда тем и другим одновременно.
Вирусы обычно намного меньше бактерий. Большинство из них являются субмикроскопическими, размером от до 10-250 нанометров до .
По своей структуре вирусы намного проще бактерий.Каждый вирус содержит геном одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК, которая функционирует как его генетический материал. Он окружен белковой оболочкой, называемой капсидом , или ядром, состоящим из белковых субъединиц, называемых капсомерами. Многие вирусы состоят не более чем из нуклеиновой кислоты и капсида, и в этом случае их называют нуклеокапсидом или голыми вирусами .
Большинство вирусов животных имеют оболочку , окружающую нуклеокапсид, и называются вирусами с оболочкой .Оболочка обычно выходит из мембран клетки-хозяина в результате процесса, называемого почкованием, хотя вирус действительно включает в оболочку собственный гликопротеин.
Для получения дополнительной информации о вирусной структуре см. Блок 4, Раздел IVC в Руководстве по лекциям.
Бактериофаги — это вирусы, поражающие только бактерии. Помимо нуклеокапсида или головы, некоторые из них имеют довольно сложную структуру хвоста, которая используется для адсорбции на клеточной стенке бактерии-хозяина (рис. 1).
Поскольку у вирусов отсутствуют органеллы, а репликация полностью зависит от метаболического аппарата клетки-хозяина, их нельзя выращивать в синтетических средах. В лаборатории вирусы животных выращивают на животных, в яйцах с эмбрионами или в культуре клеток. (В культуре клеток клетки животного-хозяина выращивают в синтетической среде, а затем заражают вирусами.) Вирусы растений выращивают в растениях или в культуре растительных клеток. Бактериофаги выращиваются на чувствительных бактериях.
Сегодня мы будем работать с бактериофагами, так как это самые простые вирусы для изучения в лаборатории.Большинство бактериофагов, таких как колифаг Т4, которые мы используем сегодня, реплицируются в течение литического жизненного цикла и называются литическими бактериофагами .
Для получения дополнительной информации о литическом жизненном цикле бактериофага см. Блок 4, Раздел IVG1 в Руководстве по лекциям.
Литический жизненный цикл колифага Т4 состоит из следующих этапов:
1. Адсорбция (рис. 2)
Сайты прикрепления на хвосте бактериофага адсорбируются на рецепторных сайтах на клеточной стенке чувствительной бактерии-хозяина.
2. Проникновение (рис. 3)
Фермент бактериофага «просверливает» отверстие в стенке бактериальной клетки, и бактериофаг вводит свой геном в бактерию. Начинается период затмения, период, когда в бактерии не обнаруживаются интактные бактериофаги.
3. Реплика (Рис. 4 и Рис. 5)
Ферменты, кодируемые геномом бактериофага, останавливают синтез макромолекул бактерии (белок, РНК, ДНК). Геном бактериофага реплицируется, и метаболический аппарат бактерии используется для синтеза ферментов бактериофага и структурных компонентов бактериофага.
4. Созревание (рис. 6)
Части бактериофага собираются вокруг генома.
5. Выпуск (рис. 7)
Лизоцим, кодируемый бактериофагом, расщепляет бактериальный пептидогликан, вызывая осмотический лизис бактерии и высвобождение интактных бактериофагов.
6. Повторное заражение
От 50 до 200 бактериофагов могут быть произведены на одну инфицированную бактерию, и теперь они заражают окружающие бактерии.
Некоторые бактериофаги реплицируются лизогенным жизненным циклом и называются умеренными бактериофагами. Когда умеренный бактериофаг заражает бактерию, он может либо 1) реплицироваться в течение литического жизненного цикла и вызывать лизис бактерии-хозяина, или 2) включать свою ДНК в ДНК бактерии и переходить в неинфекционное состояние. В последнем случае цикл начинается с того, что бактериофаг адсорбируется на бактерии-хозяине и вводит ее геном, как в литическом цикле (рис. 14 и рис.15). Однако бактериофаг не уничтожает бактерию-хозяин. Вместо этого ДНК бактериофага встраивается или интегрируется в ДНК бактерии-хозяина (рис. 16). На этом этапе вирус называется профагом . Экспрессия генов бактериофагов, контролирующих репликацию бактериофагов, подавляется репрессорным белком, и ДНК бактериофага реплицируется как часть бактериального нуклеоида. Однако примерно у одной из миллиона или одного из миллиарда бактерий, содержащих профаг, происходит спонтанной индукции (рис.17). Гены бактериофагов активируются, и бактериофаги продуцируются, как в литическом жизненном цикле (рис. 18-21).
Для получения дополнительной информации о лизогенном жизненном цикле бактериофага см. Блок 4, Раздел IVG2 в Руководстве по лекциям.
Сегодня вы заразите бактерию Escherichia coli B ее специфическим бактериофагом, колифагом T4.
В первой части лаборатории вы выполните подсчет зубного налета. Зубной налет — это небольшой прозрачный участок на чашке с агаром, где бактерии-хозяева были лизированы в результате литического жизненного цикла инфекционных бактериофагов.По мере того, как бактерии размножаются на пластине, они образуют «лужайку» сплошного роста. Между тем, каждый бактериофаг, адсорбирующийся на бактерии, будет воспроизводить и вызывать лизис этой бактерии. Затем выпущенные бактериофаги заражают соседние бактерии, вызывая их лизис. В конце концов на пластине наблюдается видимая самоограничивающаяся область лизиса, бляшка.
Вторая часть лаборатории продемонстрирует вирусную специфичность. Вирусная специфичность означает, что конкретный штамм бактериофага будет адсорбироваться только на конкретном штамме восприимчивой бактерии-хозяина.Фактически, вирусная специфичность так же специфична, как реакция фермент-субстрат или реакция антиген-антитело. Следовательно, вирусная специфичность иногда может использоваться как инструмент для идентификации неизвестных бактерий. Известные бактериофаги используются для идентификации неизвестных бактерий путем наблюдения за тем, лизируются ли бактерии. Это называется фаготипированием .
Типирование фага полезно для идентификации штаммов таких бактерий, как Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и видов Salmonella .Например, используя серию известных стафилококковых бактериофагов против Staphylococcus aureus , выделенного из данной среды, можно определить, идентичен ли он штамму Staphylococcus aureus , выделенному из поражения или из пищи, или отличается от него. Это может быть полезно при отслеживании пути передачи.
A. СЧЕТЧИК ДОКЛАДКИ
МАТЕРИАЛЫ
1 пробирка, содержащая 9,9 мл стерильного физиологического раствора; 3 пробирки по 9.0 мл стерильного физиологического раствора; 3 стерильные пустые пробирки для разведения; 3 чашки с триптиказо-соевым агаром; 3 стерильные пипетки по 1,0 мл; 1 стерильная пипетка 10,0 мл; бутылка с расплавленной средой для испытания подвижности из водяной бани, выдерживаемой при 47 ° C.
КУЛЬТУРЫ
Триптиказо-соевый бульон, культура Escherichia coli B, суспензия колифага Т4.
ПРОЦЕДУРА (выполняется группами по три человека)
1. Возьмите 1 пробирку, содержащую 9,9 мл стерильного физиологического раствора, 3 пробирки, содержащие 9.0 мл стерильного физиологического раствора и 3 стерильные пустые пробирки для разведения и промаркируйте пробирки, как показано на рис. 8. Пометьте 3 чашки TSA: 10 -4 , 10 -5 и 10 -6 .
2. Разведите исходный раствор Coliphage T4 , как описано ниже и показано на рис. 8.
а. Достаньте из пакета стерильную пипетку 1,0 мл . Не прикасайтесь к той части пипетки, которая войдет в пробирки, и не кладите пипетку на . От кончика пипетки до отметки «0» — 1 мл ; каждое пронумерованное деление (0.1, 0,2 и т.д.) представляет собой 0,1 мл ; каждое деление между двумя числами соответствует 0,01 мл (см. фиг. 11).
г. Вставьте конец пипетки с ватным концом в наполнитель для пипеток blue 2 мл.
г. Откройте крышку образца Coliphage T4, вставьте пипетку в нижнюю часть пробирки и извлеките 0,1 мл (см. Рис. 11) образца, повернув ручку наполнителя в направлении вас. Закройте трубку.
г. Поместите край пробирки для разбавления 10 -2 в отверстие микроинсинератора на 2-3 секунды и выдавите 0.1 мл Coliphage T4 в пробирку, повернув ручку наполнения от себя на . Несколько раз втяните жидкость в пипетку вверх и вниз, чтобы промыть пипетку и облегчить перемешивание. Подожгите и закройте трубку. Это даст разведение бактериофага 1/100 или 10 -2 .
e. С помощью вихревой мешалки м тщательно перемешайте трубку . Это необходимо для равномерного распределения бактериофага по жидкости.
ф. Используя ту же пипетку и ту же процедуру, извлеките 1 в асептических условиях.0 мл (см. Рис. 11) из пробирки для разбавления 10 -2 и перелить в пробирку для разбавления 10 -3 . Это даст разведение бактериофага 1/1000 или 10 -3 . С помощью вихревой мешалки м тщательно перемешайте трубку .
г. Используя ту же пипетку и процедуру, в асептических условиях извлеките 1,0 мл (до линии «0»; см. Рис. 11) из пробирки для разбавления 10 -3 и распределите в пробирку для разбавления 10 -4 .Это даст разведение бактериофага 1/10 000 или 10 -4 . С помощью вихревой мешалки м тщательно перемешайте трубку .
ч. Используя ту же пипетку и процедуру, в асептических условиях извлеките 1,0 мл (см. Рис. 11) из пробирки для разведения 10 -4 и распределите в пробирку для разведения 10 -5 . Это даст разведение бактериофага 1/100 000 или 10 -5 . С помощью вихревой мешалки м тщательно перемешайте трубку .Выбросьте пипетку в контейнер для биологических отходов.
3. Возьмите 3 пустые стерильные пробирки и обработайте, как описано ниже и показано на рис. 8.
а. Используя новую стерильную пипетку 1,0 мл и процедуру, описанную выше, асептически удалите 0,1 мл (см. Рис. 11) из разведения бактериофага 10 -5 и распределите в пустую пробирку 10 -6 .
г. Используя ту же пипетку и процедуру, асептически удалите 0,1 мл из разведения бактериофага 10 -4 и внесите в пустую пробирку 10 -5 .
г. Используя ту же пипетку и процедуру, асептически удалите 0,1 мл из разведения бактериофага 10 -3 и внесите в пустую пробирку 10 -4 . Выбросьте пипетку в контейнер для биологических отходов.
4. Используя новую стерильную пипетку 1,0 мл , добавьте 0,5 мл (см. Рис. 11) из E. coli B к 0,1 мл бактериофага в каждой из 3 пробирок из шага 3, как показано. на рис. 9. Используя вихревой смеситель, м тщательно перемешайте трубку .Выбросьте пипетку в контейнер для биологических отходов.
5. Используя стерильную пипетку 10,0 мл , добавьте 2,5 мл (см. Рис. 12) стерильной расплавленной испытательной среды подвижности к смеси E. coli -бактериофаг в каждой из 3 пробирок. начиная с шага 4, как показано на рис. 10. Используя вихревой смеситель, m тщательно перемешайте трубку . Выбросьте пипетку в контейнер для биологических отходов.
6. Быстро залейте подвижную среду — E.Смеси coli -бактериофаг на отдельные чашки с триптиказо-соевым агаром и перемешивают, чтобы распределить содержимое по всей поверхности агара.
7. Инкубируйте 3 чашки TSA правой стороной вверх и сложите стопкой в держателе чашек Петри на полке инкубатора 37 ° C, соответствующем вашей лабораторной секции, до следующего лабораторного периода.
B. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВИРУСА
МАТЕРИАЛЫ
Триптиказо-соевый агар (2)
КУЛЬТУРЫ
Триптиказо-соевый бульон с культурами 4 неизвестных бактерий, обозначенных №1, №2, №3 и №4; суспензия колифага Т4.
ПРОЦЕДУРА (выполняется группами по три человека)
1. С помощью воскового маркера нарисуйте линию на дне обеих чашек с триптиказо-соевым агаром, разделив их пополам. Пронумеруйте 4 сектора 1, 2, 3 и 4, чтобы соответствовать 4 неизвестным бактериям.
2. Нарисуйте круг размером с монету в центре каждого из 4 секторов (см. Рис. 13).
3. Используя стерильную инокуляционную петлю, нанесите полосу на неизвестную бактерию № 1 на сектор 1 первой чашки с триптиказо-соевым агаром, проведя полосой петли по нарисованному вами кругу . Будьте осторожны, чтобы не попасть на другую половину пластины.
4. Полоса неизвестной бактерии № 2 в секторе 2 первой чашки с триптиказо-соевым агаром.
5. Полоса неизвестной бактерии № 3 в секторе 3 второй чашки с триптиказо-соевым агаром.
6. Полоса неизвестной бактерии № 4 в секторе 4 второй чашки с триптиказо-соевым агаром.
7. Попросите инструктора добавить 1 каплю концентрированного колифага Т4 в каждый сектор области, обведенной кружком.
8. Инкубируйте 2 чашки TSA правой стороной вверх и сложите их в держатель для чашек Петри на полке инкубатора 37 ° C, соответствующей вашему лабораторному участку, до следующего лабораторного периода.
РЕЗУЛЬТАТЫ
A. Счетчик налета
Посмотрите на 2 пластины для образования налета и сделайте чертеж.
B. Специфичность вируса
Нарисуйте свои результаты и укажите, какое из неизвестных (№ 1, № 2, № 3 или № 4) было E.coli .
ЗАДАЧИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРИИ 11
После завершения этой лабораторной работы студент сможет выполнять следующие задачи:
ОБСУЖДЕНИЕ
- Определите следующее: типирование бактериофага, бляшки и фага.
- Опишите структуру бактериофага колифага Т4.
- Опишите литический жизненный цикл бактериофагов.
- Определите вирусную специфичность.
РЕЗУЛЬТАТЫ
- Распознайте бляшки и укажите их причину.
- Интерпретируйте результаты теста на вирусную специфичность с использованием Coliphage T4.
САМОИКТОРИНА
Самопроверка
ответы
Авторы и авторство
Вирусов, питающихся бактериями, можно обеспечить стабильность при муковисцидозе
Элла Баласа вдыхает лекарство от фага в больнице Winchester Chest Clinic в Нью-Хейвене, штат Коннектикут.Предоставлено: Ричард Дрю / Associated Press / Shutterstock
.После более чем десятилетия инфекций, устойчивых к лекарствам, у Эллы Баласа было мало вариантов. Бактерия Pseudomonas aeruginosa , распространенная у людей с муковисцидозом, надолго поселилась в легких Баласы, разъедая оставшуюся здоровую ткань легких. Функция легких у Баласы упала ниже 20% от нормы, и в 26 лет она зависела от дополнительного кислорода. «Мне требовались постоянные ингаляции оральных антибиотиков», — говорит Баласа.«Я знал, что это неэффективно».
Затем Баласа, который живет в Ричмонде, штат Вирджиния, дал интервью для документального фильма о бактериофагах, или сокращенно фагах. Эти специализированные вирусы, убивающие бактерии, обещали искоренить устойчивые инфекции, подобные ее. Очарованный, Баласа нашел биолога Бенджамина Чана, который проводил экспериментальное лечение фагами в Йельском университете в Нью-Хейвене, штат Коннектикут, и спросил его, может ли она быть кандидатом.
Исследователи муковисцидоза долгое время рассматривали фаги как последнее средство — второстепенное лечение, предлагаемое только в Восточной Европе, давнем эпицентре исследований фагов, и в некоторых других местах.Но растущая проблема инфекций, устойчивых к антибиотикам, вызвала новый интерес к естественным вирусам. Некоторые врачи сейчас используют фаги для лечения локализованных бактериальных инфекций и для обеспечения безопасного заживления ран, хотя эти методы лечения еще не считаются общепринятыми. Поскольку фаги могут победить бактерии, когда антибиотики неэффективны, люди с поздней стадией муковисцидоза все чаще обращаются за лечением из соображений сострадания. Специальная сеть вирусологов, пульмонологов, клиницистов и других специалистов активизировалась, чтобы найти нужные штаммы фагов для лечения инфекций пациентов.
Такой подход вызвал интерес у крупных исследовательских центров и фармацевтических компаний. К концу 2020 года компания Armata Pharmaceuticals в Марина-дель-Рей, Калифорния, планирует начать одно из первых клинических испытаний фаговой терапии муковисцидоза, финансируемое за счет гранта в размере 5 миллионов долларов США от некоммерческой организации Cystic Fibrosis Foundation. в Бетесде, штат Мэриленд. Планируется, что аналогичные испытания начнутся и на других сайтах. Тем временем лаборатории и поставщики продолжают поставлять индивидуализированные смеси фагов людям с инфекциями, связанными с муковисцидозом.Фаги — это «Богородица, которая сейчас здесь», — говорит Эмили Крамер-Голинкофф, больная муковисцидозом и основательница финансирующей исследования некоммерческой организации Emily’s Entourage в Мерион-Стейшн, штат Пенсильвания. «Мы должны быть оппортунистами как сообщество, потому что на кону жизни людей».
Хроническая инфекцияОтличительным признаком муковисцидоза является густая слизь, которая сильно затрудняет дыхание. Эта слизь также является идеальной средой для размножения устойчивых к антибиотикам бактерий, включая штаммы Pseudomonas , Mycobacterium и Burkholderia .
Такие устойчивые к лекарствам инфекции могут сохраняться годами и серьезно ухудшать функцию легких. Если они сильно продвинуты, они могут также лишить пациентов права на трансплантацию легкого — одно из немногих методов лечения, которое значительно замедляет прогрессирование болезни.
Правильные фаги могут уничтожить эти резидентные легочные бактерии. Фаги прикрепляются к поверхности бактериальных клеток и внедряют свой генетический материал, захватывая механизмы бактерии и заставляя их производить тысячи фагов.Затем переполненная бактериальная клетка лопается, высвобождая вирусы. «Фаги размножаются в месте заражения и продолжают уничтожать бактерии», — говорит Грег Меррил, исполнительный директор биотехнологической компании Adaptive Phage Therapeutics (APT) в Гейтерсбурге, штат Мэриленд. Поскольку каждый фаг атакует определенный штамм бактерий, лечение не повреждает окружающие ткани.
Исследования по использованию фагов у людей с муковисцидозом являются многообещающими. В ходе исследования, проведенного в Центре медицинских исследований ВМС США в Силвер-Спринг, штат Мэриленд, было проведено лечение фагами 13 человек, у 4 из которых был муковисцидоз 1 .В 11 из 13 фаги уничтожили целевые бактерии. А у 15-летнего пациента с муковисцидозом, который лечился коктейлем из трех фагов, заметно улучшилось состояние: не только исчезла лекарственно-устойчивая инфекция, но и восстановилась функция легких и печени 2 .
Хотя фаговая терапия — это не нокаут против муковисцидоза, она может быть способом выиграть время. Если курс фагов может вытеснить лекарственно-устойчивую инфекцию, пациент может выздороветь достаточно, чтобы стать кандидатом на трансплантацию легких.Фаги подходят «на уровне улучшения и продления жизни, уничтожая бактерий, которые действительно вызывают проблемы», — говорит микробиолог Джессика Захер из Университета Альберты в Эдмонтоне, Канада.
25-летняя женщина из Калифорнии, Мэллори Смит, которая много лет боролась с лекарственно-устойчивой инфекцией Burkholderia cepacia , была среди первых людей с муковисцидозом, получивших фаговую терапию в Соединенных Штатах. Ее отец, Марк Смит, обратился к нескольким фагологам, в том числе к эпидемиологу Стеффани Стратди из Калифорнийского университета в Сан-Диего.В ноябре 2017 года Стратди спросил исследователей в Твиттере, есть ли у них штамм фага, который работает на B. cepacia .
Strathdee нашла подходящую бактерию, но не вовремя: болезнь Мэллори была настолько серьезной, что она умерла, прежде чем фаги смогли подействовать. Тем не менее вскрытие показало, что они уже начали уничтожать бактериальные колонии Мэллори, убедив Стратди, что фаговая терапия может быть огромным благом для других людей с муковисцидозом. Под руководством Стратди в 2018 году университет открыл Центр инновационных фаговых приложений и терапии (IPATH), одной из специальностей которого является муковисцидоз.
Микрофотография фагов, атакующих бактерию Авторы: Tom Deerinc
Наряду с Phage Directory, некоммерческой организацией в Атланте, штат Джорджия, соучредителем которой является Захер, IPATH помогает подбирать людям с кистозным фиброзом на поздней стадии фаги, нацеленные на их инфекции. Когда пациенту необходимы фаги для лечения устойчивой к антибиотикам инфекции, запрос по электронной почте или в социальных сетях отправляется в десятки исследовательских лабораторий. Эти лаборатории сканируют свои коллекции фагов, чтобы узнать, есть ли в них подходящий фаг для уничтожения бактерии человека.Как только лаборатория находит идеальный фаг, техники выращивают миллиарды вирусов и отправляют их. На данный момент Phage Directory координирует поиск фагов для семи или восьми пациентов. Другие получили фаги по независимым договоренностям с лабораториями в других местах.
Узнав от Баласы, Чан сказал ей, что возьмется за ее дело. В Йельском университете у него были фаги, которые будут бороться с P. aeruginosa в ее легких, и Баласа запланировал поездку в Нью-Хейвен, чтобы начать лечение. Но по мере приближения свидания ее состояние ухудшалось.«У меня была действительно серьезная вспышка инфекции. Я очень нервничала », — вспоминает она. В ее голове мелькали наихудшие сценарии: что, если обработка фагом заставит ее дыхательные пути набухать и сжиматься? Но она все равно решила довести дело до конца. Она знала, что существующий статус-кво — мегадозы антибиотиков — будет неэффективным.
В поисках нужного фагаНесмотря на свои опасения, Баласа знала, что ей повезло найти исследователя, который смог бы вылечить ее. На поиск нужного фага могут уйти месяцы кропотливой, неоплачиваемой детективной работы, даже когда Phage Directory всегда под рукой.Из 260 пациентов, запросивших фаговую терапию в бельгийской больнице в период с 2013 по 2018 год, примерно половине пришлось отказать, потому что в больнице не было нужных фагов 3 . «Пациенты с муковисцидозом действительно хотят этого, и они хотят этого сейчас», — говорит Стратди. «Иногда пациенты и их близкие злятся из-за того, что мы не можем им помочь».
Чтобы упростить процесс сопоставления фага и пациента, некоторые исследователи создают стандартизированные библиотеки фагов. Phage Directory составляет базу данных с открытым доступом, которая индексирует коллекции по всему миру, и в 2019 году исследователи из Медицинского колледжа Бейлора в Хьюстоне, штат Техас, сообщили, что они создали библиотеки, которые работают против трех распространенных патогенов 4 .В марте Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило приложение APT для создания всеобъемлющей фаговой библиотеки под названием PhageBank. По словам Стратди, поиск фагов в случайных лабораториях или в природе «требует времени». «Если у вас есть фаговая библиотека, это как гигантский холодильный шкаф».
Еще одним препятствием является то, что фаговая терапия не всегда вписывается в стандартные рамки клинических испытаний. В большинстве испытаний лекарств каждый участник тестовой группы получает точно такое же лекарство в одинаковой дозе. Но с фагами такой подход может оказаться непрактичным.При муковисцидозе у многих людей лекарственно-устойчивые инфекции очень необычны, поэтому от врачей требуется создавать индивидуальные препараты фага.
Предстоящее исследование фага Armata Pharmaceuticals позволяет обойти эту проблему за счет использования смеси фагов, нацеленных только на P. aeruginosa . Другие исследователи выбирают менее традиционные маршруты. По приказу молекулярного биолога Жана-Поля Пирне из военного госпиталя Королевы Астрид в Брюсселе регулирующие органы Бельгии теперь разрешают использование фагов в том, что Пирне называет «магистральными препаратами».Это означает, что фармацевты могут легально создавать индивидуальные смеси фагов для отдельных пациентов, используя коммерческий банк фагов, предварительно одобренный правительством Бельгии. «Вы берете те, которые работают, вы можете их смешивать», — говорит Пирнай. «Вы можете приготовить суспензию для внутривенного введения или назальный спрей».
APT предпринимает аналогичные шаги в своем клиническом испытании, начало которого запланировано на конец года. Компания будет использовать свою собственную библиотеку для создания персонализированных коктейлей с фагами для участников, и в ходе испытания будет оценена эффективность этого подхода.
Безопасность должна оставаться превыше всего, говорит Элизабет Бургенер, изучающая микробные взаимодействия у людей с муковисцидозом в Стэнфордском университете в Калифорнии. Перед утверждением исследователи продолжат оценку долгосрочных эффектов фагов у первых реципиентов — например, отслеживая, изменяют ли вирусы общий бактериальный баланс в легких и вызывают ли они отек в инфицированных дыхательных путях.
Изменяет жизнь17 января 2019 года Элла Баласа вдохнула свою первую дозу фагов через небулайзер в палате Йельской клиники.Семь дней спустя она не заметила улучшения своих симптомов. Когда она вернулась в Ричмонд, ее лечащий врач дал обескураживающую оценку лечения. «Он сказал:« Очевидно, это мало для вас делает ». Вам, вероятно, понадобится пересадка », — вспоминает Баласа.
Несколько дней спустя, когда Баласа был в Университете Дьюка в Дареме, Северная Каролина, для оценки трансплантации легких, все начало меняться. «Я начал откашливать всю эту темную старую слизь», — говорит Баласа.«Это только начало выходить наружу». Из прошлого опыта она знала, что это означает, что ее инфекция проходит. Она тоже начала восстанавливать силы — до лечения она чувствовала себя слишком слабой, даже чтобы мыть голову. Вскоре Чан подтвердила с помощью бактериальных культур, что количество ее устойчивых к лекарствам бактерий действительно уменьшается.
Хотя фаги помогли победить инфекцию Баласы, они не смогли восстановить поврежденные ткани. Функция ее легких сейчас колеблется примерно на 25% от нормы. Тем не менее, лечение Чан помогло стабилизировать ее состояние настолько, что она отложила трансплантацию легкого и вместо этого начала лечение препаратом Трикафта.
